Prenatal screening aneuploidies using Cell-free fetal DNA

• Updated Ob-Gyn
• Prenatal screening aneuploidies using Cell-free fetal DNA

การตรวจคัดกรองความผิดปกติของโครโมโซมที่พบได้บ่อย
โดยวิธีการตรวจสารพันธุกรรมทารกในเลือดมารดา
(Prenatal screening for common aneuploidies
using Cell-free fetal DNA)

รศ. พญ. กุณฑรี ไตรศรีศิลป์ หมื่นพินิจ

---

บทนำ

ความผิดปกติของโครโมโซมที่พบได้บ่อยในที่นี้ หมายถึง ความผิดปกติของโครโมโซมที่มีจำนวนเพิ่มขึ้นจากสองแท่งเป็นสามแท่งของคู่ที่ 13, 18 และ 21 รวมทั้งโครโมโซมเพศ ซึ่งปัจจุบันมีการตรวจคัดกรองได้หลายวิธี ทั้งจากการอัลตราซาวน์ (ultrasound marker) การดูปริมาณสารชีวเคมีในเลือดมารดา(serum biochemistry) และการตรวจดูสารพันธุกรรมทารกในเลือดมารดา (cell-free fetal DNA: cffDNA) ในที่นี้จะกล่าวถึงการตรวจคัดกรองโดย cff DNA ซึ่งกำลังเป็นวิธีที่ได้รับความนิยมเพิ่มมากขึ้น ดังนั้นในฐานะแพทย์ และผู้ให้บริการด้านสาธารณสุขควรจะมีความรู้และข้อมูลเกี่ยวกับการตรวจดังกล่าว เพื่อจะได้ให้คำปรึกษาแนะนำแก่สตรีตั้งครรภ์และครอบครัวได้อย่างเหมาะสม

หลักการของ cell free DNA (cfDNA)

Cell free DNA (cfDNA) ที่อยู่ในกระแสเลือดมารดา ประกอบด้วยดีเอ็นเอทั้งของมารดาและทารก โดยดีเอ็นเอของมารดาส่วนใหญ่มาจากเซลล์ของระบบโลหิต (hematopoietic cells) ส่วนดีเอ็นเอของทารก คิดเป็นสัดส่วนร้อยละ 3-13 ของดีเอ็นเอทั้งหมด ⁽¹⁾ มาจากการ apoptosis ของ syncytiotrophoblast เป็นส่วนใหญ่ และบางส่วนมาจาก erythroblast^(2-4) cfDNA ที่อยู่ในกระแสเลือดมารดา จะเป็นชิ้นส่วนเล็ก ๆ ที่มีขนาด 50-200 คู่เบส โดยสามารถตรวจพบ cffDNA ในกระแสเลือดมารดาได้ตั้งแต่อายุครรภ์ 5 สัปดาห์⁽⁵⁾ และจะถูกกำจัดออกไปจากกระแสเลือดมารดาอย่างรวดเร็วภายใน 2 วันหลังคลอด^{(6, 7)} เนื่องจากเด็กและรกมาจากเซลล์ต้นกำเนิดเดียวกัน ทำให้เชื่อว่ามีสารพันธุกรรมเหมือนกัน การที่ตรวจ cffDNA ในกระแสเลือดมารดา ก็เท่ากับการตรวจดีเอ็นเอของทารกในครรภ์ อีกทั้ง cffDNA นี้ถูกกำจัดไปอย่างรวดเร็วหลังคลอด ทำให้ผลการตรวจนี้จำเพาะสำหรับการตั้งครรภ์นั้น ๆ เมื่อตั้งครรภ์ใหม่ก็สามารถตรวจได้โดยไม่ถูกรบกวนจากการตั้งครรภ์ก่อนหน้านั้น

หลักการของการตรวจ cfDNA ทางห้องปฏิบัติการ มี 2 วิธีหลัก

1. การนับจำนวนชิ้นส่วนของ DNA (cfDNA fragments counting) ที่จำเพาะกับโครโมโซมนั้น ๆ ว่ามีปริมาณเพิ่มขึ้นหรือไม่ ตัวอย่างเช่น ในหญิงปกติทั่วไปที่ไม่ได้ตั้งครรภ์ ชิ้นส่วนของดีเอ็นเอที่มาจากโครโมโซมคู่ที่ 21 มีอยู่ร้อยละ 1.3 ของชิ้นส่วนดีเอ็นเอทั้งหมด เมื่อหญิงปกติตั้งครรภ์และทารกในครรภ์ปกติ (euploid mother and fetus) สัดส่วน ของดีเอ็นเอที่มาจากโครโมโซมคู่ที่ 21 จะยังคงเป็นร้อยละ 1.3 แต่ถ้าทารกในครรภ์มีโครโมโซมคู่ที่ 21 เกินมา (trisomy 21) สัดส่วนของดีเอ็นเอที่มาจากโครโมโซมคู่ที่ 21 จะสูงขึ้น ทางห้องปฏิบัติการจะมีเทคนิคการตรวจที่แตกต่างไปอีก คือ การนับชิ้นส่วนดีเอ็นเอของทุกโครโมโซม (whole genome sequencing) หรือนับเฉพาะโครโมโซมที่สนใจ (targeted sequencing) ซึ่งได้แก่โครโมโซมคู่ที่ 21, 18, 13 และโครโมโซม X, Y
2. การดูลักษณะแบบแผน ของ single nucleotide polymorphisms (SNPs based) SNPs เป็นความแปรปรวนของคู่เบสที่เกิดขึ้นในตำแหน่งที่จำเพาะของสารพันธุกรรม ทำให้แต่ละบุคคลมีความแตกต่างกัน SNPs ของ cfDNA ของหญิงตั้งครรภ์ จะถูกนำไปเปรียบเทียบกับฐานข้อมูลประชากร หากพบว่าแบบแผนของ SNPs เปลี่ยนแปลง จะหมายถึงมีโครโมโซมเกินมาหรือขาดหายไป

ปัจจัยที่มีผลต่อการตรวจด้วยวิธี cfDNA

เนื่องจากการตรวจนี้ส่วนใหญ่เป็นการดูความแตกต่างของปริมาณดีเอ็นเอ ดังนั้นถ้าสัดส่วนของดีเอ็นเอที่มาจากทารก (fetal fraction) น้อยเกินไป อาจทำให้ไม่เห็นความแตกต่างของปริมาณดีเอ็นเอที่เปลี่ยนแปลง ทำให้ไม่สามารถแปลผลได้ (no result) หรือให้ผลลบลวง (false negative) โดยปัจจัยที่มีผลต่อ fetal fraction คือ

1. อายุครรภ์ cffDNA จะเริ่มตรวจพบเมื่ออายุครรภ์ 5 สัปดาห์ และจะพบในทุกการตั้งครรภ์เมื่ออายุครรภ์ 9 สัปดาห์⁽⁵⁾ ปริมาณ cffDNA จะเพิ่มขึ้นตามอายุครรภ์ ในช่วงแรกอาจเพิ่มช้า ๆ ประมาณร้อยละ 0.1 ต่อสัปดาห์ แต่หลัง 20 สัปดาห์จะเพิ่มขึ้นร้อยละ 1 ต่อสัปดาห์⁽⁸⁾ ดังนั้นห้องปฏิบัติการส่วนใหญ่จะทำการตรวจเมื่ออายุครรภ์ มากกว่าหรือเท่ากับ 10 สัปดาห์ เพื่อให้แน่ใจว่ามี ปริมาณ cffDNA มากพอ ซึ่งโดยเฉลี่ยจะพบ fetal cfDNA ประมาณร้อยยละ 4 ของ maternal cfDNA
2. น้ำหนักของมารดา มารดาที่น้ำหนัก หรือ ดัชนีมวลกาย (BMI) มาก จะทำให้สัดส่วน fetal cfDNA ลดลง เนื่องจากปริมาตรของพลาสมาในมารดา และดีเอ็นเอของมารดาที่มากขึ้น⁽⁹⁾ โดยเฉพาะมารดาที่มีน้ำหนักมากกว่า 80 กิโลกรัมขึ้นไป⁽¹⁾
3. การเก็บตัวอย่างเลือด หากเก็บไม่ถูกวิธี จะทำให้เม็ดเลือดขาวของมารดาแตก ส่งผลให้ maternal cfDNA ไปเจือจาง fetal cfDNA ดังนั้นแนะนำให้เก็บตัวอย่างเลือดใส่หลอด EDTA แล้วปั่นภายใน 6 ชั่วโมง เพื่อให้ได้พลาสมา เก็บที่ -80 °C
4. Karyotype ของทารกในครรภ์ จากการศึกษาพบว่า ทารกที่เป็น trisomy 13, 18 หรือ Turner syndrome จะมีสัดส่วนของ fetal DNA น้อยกว่า euploid fetus หรือ trisomy 21 ที่อายุครรภ์เท่ากัน ทำให้โอกาสที่จะตรวจพบความผิดปกติ (detection rate) น้อยกว่า หรือไม่สามารถออกผลการตรวจได้ (test failures or no result)⁽¹⁰⁾ มีรายงานหนึ่งพบว่าร้อยละ 22 ของรายที่ไม่สามารถออกผลการตรวจได้ ทารกนั้นมีความผิดปกติของโครโมโซม⁽¹¹⁾

ความสามารถของการตรวจคัดกรองโดยวิธี cffDNA

การตรวจคัดกรองโดย cff DNA เป็นการตรวจที่ให้ผลค่อนข้างดี คือ detection rate โดยรวมสำหรับ trisomy 21, 18, 13 อยู่ที่ร้อยละ 97 ผลบวกลวง (false positive rate) ร้อยละ 1.25 ทั้งนี้มีความแตกต่างกันเล็กน้อยในแต่ละ trisomy สำหรับความผิดปกติของโครโมโซมเพศ ความสามารถในการตรวจพบต่ำกว่า ดังแสดงในตารางที่ 1 นอกจากนี้สิ่งที่ควรทราบเพิ่มเติมคือ เมื่อ cffDNA ให้ผลบวก โอกาสที่ทารกในครรภ์จะเป็นโรคจริง ๆ (positive predictive value: PPV) ยังมีความแตกต่างกันไปในกลุ่มประชากร เนื่องจากการคำนวณ PPV ขึ้นกับความชุก (prevalence) ของโรค ดังนั้น PPV จะสูงถ้าตรวจในกลุ่มเสี่ยงหรือในสตรีตั้งครรภ์ที่อายุมาก แต่ PPV จะต่ำลงเมื่อตรวจในประชากรทั่วไป หรือในสตรีตั้งครรภ์ที่อายุน้อย และเมื่อ cffDNA ให้ผลลบ โอกาสที่ทารกในครรภ์จะปกติ (negative predictive value) ก็สูงมากถึงร้อยละ 99.9

การตรวจคัดกรองโดย cff DNA มีรายงานว่าไม่สามารถออกผลได้ (test failures or no result) ถึงร้อยละ 1-5 สำหรับความผิดปกติของ autosome และสูงขึ้นถึงร้อยละ 4-7 สำหรับความผิดปกติของ sex chromosome โดยปัจจัยที่มีผลคือ สัดส่วนของ cffDNA ที่ต่ำไป ทำให้ปริมาณ DNA ไม่เพียงพอสำหรับการวิเคราะห์

ปัจจัยที่ทำให้เกิดผลบวกลวง หรือผลลบลวง (false-positive or false-negative)

1. Confined placental mosaicism เนื่องจากแหล่งหลักของ fetal cfDNA มาจากรก ซึ่งพบได้ร้อยละ 1-2 ที่สารพันธุกรรมของรก และทารกมีความแตกต่างกัน ⁽¹⁴⁾ คือรกเป็น aneuploidy แต่ทารกปกติ(euploid) ทำให้เกิดผลบวกลวง หรือ รก euploid แต่ทารก aneuploidy ทำให้เกิดผลลบลวง
2. Demised twin หากแฝดที่เสียชีวิตไปมีความผิดปกติของโครโมโซม รกของแฝดนั้นยังสามารถปล่อยดีเอ็นเอเข้าสู่กระแสเลือดมารดาได้⁽¹⁵⁾ ทำให้เกิดผลบวกลวง
3. Maternal mosaicism เมื่ออายุมากขึ้น พบว่าจะมีการหายไปของโครโมโซม X แม้เป็นสัดส่วนเพียงเล็กน้อย แต่อาจทำให้การแปลผลผิดว่าทารกในครรภ์เป็น Turner syndrome ได้⁽¹⁶⁾
4. Maternal cancer ให้สงสัยกรณีที่ผลการตรวจพบมากกว่าหนึ่ง aneuploidy ซึ่งเป็นภาวะที่พบได้น้อย ประมาณร้อยละ 0.03⁽¹⁷⁾ มีรายงานว่ามารดาเป็นมะเร็งชนิด neuroendocrine, leukemia, lymphoma, colorectum, และ anus

ตารางที่ 1 แสดงความสามารถของการตรวจโดยวิธี cffDNA

Disorder	Detection rate (%)*	False positive rate (%)*	Positive predictive value (%)**
Autosomal aneuploidies			Age 25 (low risk)	Age 40 (high risk)
Trisomy 21	98.6	1.01	33	87
Trisomy 18	94.9	0.14	13	68
Trisomy 13	91.3	0.14	9	57
All Three	97.0	1.25	–	–
Sex chromosome aneuploidies
45,X	90.3	0.23	–	–
47XXY, 47XYY, 47XXX	93.0	0.14	–	–
All sex chromosome aneuploidies			20-40

ดัดแปลงจาก *Gil MM, Quezada MS, Revello R, et al. Analysis of cell-free DNA in maternal blood in screening for fetal aneuploidies: updated meta-analysis. Ultrasound Obstet Gynecol 2015⁽¹²⁾ ** Committee Opinion No. 640: Cell-free DNA Screening for Fetal Aneuploidy. Obstet Gynecol 2015 Jun 29⁽¹³⁾

1. Maternal copy number of variant หลักการของการตรวจด้วย cffDNA จะคิดว่าผู้หญิงทุกคนมีสัดส่วนของสารพันธุกรรม (genetic material) ของแต่ละโครโมโซมเท่ากัน แต่ในความจริงอาจมีการเพิ่มขึ้นหรือหายไป ของสารพันธุกรรม ซึ่งถ้าเป็นโครโมโซมที่สนใจ ก็จะทำให้การแปลผลผิดได้⁽¹⁸⁾ คือถ้ามี maternal duplication จะทำให้เกิดผลบวกลวง หรือหากมี maternal deletion จะทำให้เกิดผลลบลวง
2. Chance เนื่องจากการแปลผลบวก มักอาศัยค่าทางสถิติที่เกินกว่าค่าเบี่ยงเบนมาตรฐานไป 3 (+3 SD) ดังนั้นโอกาสเกิดผลบวกลวงในทางสถิติ พบได้ 1-2 ต่อ 1000
3. Transplant recipient หากเนื้อเยื่อของอวัยวะที่ได้รับการเปลี่ยนถ่าย มาจากผู้ชาย cfDNA อาจรายงานผลเพศของทารกผิดเป็นเพศชายได้⁽¹⁹⁾

การตรวจคัดกรองทารกที่มีความผิดปกติของโครโมโซมที่พบบ่อย โดยวิธีการตรวจสารพันธุกรรมทารกในเลือดมารดา จุดประสงค์เพื่อการตรวจคัดกรองทารกกลุ่มอาการดาวน์ (trisomy 21) เป็นหลัก แต่มักจะได้รับการตรวจหา trisomy 18 และ 13 หรือความผิดปกติของโครโมโซมเพศร่วมด้วย สำหรับประเทศไทยเอง ยังไม่มีแนวทางที่ชัดเจนเกี่ยวกับการตรวจดังกล่าว แต่ในต่างประเทศมีคำแนะนำดังนี้

• ใช้เป็นการตรวจคัดกรองสำหรับกลุ่มเสี่ยงสูง ได้แก่ อายุมากกว่า 35 ปีเมื่อครบกำหนดคลอด พบความผิดปกติจากอัลตราซาวน์ที่เพิ่มความเสี่ยงของกลุ่มอาการดาวน์ (เช่น ความหนาต้นคอหนากว่าปกติ) การตั้งครรภ์ก่อนเป็น trisomy หรือพ่อแม่เป็นพาหะของ Robertsonian translocation⁽¹³⁾
• ใช้เป็น secondary screening คือเป็นการตรวจคัดกรองอย่างที่สอง เมื่อการตรวจคัดกรองด้วยสารชีวเคมีให้ผลบวก (positive serum screening or combined first trimester screening) โดยถ้าการตรวจอย่างแรกให้ผลบวก (high risk) หรือให้ผลก้ำกึ่ง (intermediate risk) ก็แนะนำให้ตรวจด้วย cffDNA เพื่อลดความเสี่ยงจากการตรวจวินิจฉัยแบบรุกล้ำโดยไม่จำเป็น แต่คงต้องพิจารณาว่าอาจทำให้การตรวจวินิจฉัย และการตัดสินใจในการทำหัตถการใด ๆ ล่าช้าออกไปหากผล cffDNA เป็นบวก หรือคงต้องให้ข้อมูลด้วยว่าแม้ว่าการตรวจรอบสองด้วย cffDNA ให้ผลลบโอกาสที่ทารกในครรภ์ยังมีความผิดปกติของโครโมโซมได้ (residual risk) ร้อยละ 2⁽²⁰⁾

เมื่อ cffDNA ให้ผลบวก (positive test) ควรให้คำปรึกษาทางพันธุศาสตร์ ว่าโอกาสที่ทารกในครรภ์จะผิดปกติเป็นเท่าไหร่ และแนะนำให้ตรวจยืนยันด้วยการวินิจฉัยแบบรุกล้ำเสมอ ก่อนที่จะพิจารณายุติการตั้งครรภ์

เมื่อ cffDNA ให้ผลลบ (negative test) ควรให้คำปรึกษาทางพันธุศาสตร์ ว่าโอกาสที่ทารกจะปกติจริง ๆเป็นเท่าไหร่ และเน้นย้ำว่าเฉพาะโครโมโซมที่สนใจเท่านั้น แนะนำให้ทำการฝากครรภ์ต่อตามปกติ และควรได้รับการอัลตราซาวน์ในไตรมาสที่สองเพื่อประเมินความสมบูรณ์ทางโครงสร้างของทารกในครรภ์

เมื่อ cffDNA ไม่สามารถออกผลได้ (test failures or no result or no call) ยังไม่มีแนวทางที่ชัดเจนว่าควรทำอย่างไร แต่อาจพิจารณาได้ดังนี้

• ตรวจด้วย cffDNA ซ้ำอีกครั้งหนึ่ง โดยพบว่าโอกาสที่ตรวจรอบสองจะได้ผลอยู่ที่ร้อยละ 50-80(¹¹, ²¹⁾
• ตรวจด้วยสารชีวเคมี (serum analysis) ร่วมกับการตรวจอัลตราซาวน์เพื่อหาลักษณะผิดปกติของทารก
• ทำการตรวจวินิจฉัยโดยวิธีรุกล้ำ เช่น การเจาะชิ้นเนื้อรก หรือการเจาะน้ำคร่ำ เพราะดังกล่าวข้างต้นแล้วว่ากลุ่มนี้เพิ่มความเสี่ยงที่ทารกจะมีความผิดปกติของโครโมโซม

ข้อมูลที่ควรให้ในการให้คำปรึกษาทางพันธุศาสตร์สำหรับการตรวจคัดกรองด้วย cffDNA^{(13, 22)}

1. ควรให้ทางเลือกในการตรวจคัดกรองทั้งหมดที่มี เช่น การตรวจด้วยสารชีวเคมี อัลตราซาวน์ และ cffDNA
2. ยังไม่แนะนำให้ใช้เป็นการตรวจคัดกรองลำดับแรกในประชากรทั่วไป เนื่องจากความสามารถของการตรวจด้วย cffDNA โดยเฉพาะความถูกต้อง (accuracy) และทารกในครรภ์จะผิดปกติจริง ๆ เมื่อ cffDNA ให้ผลบวก (positive predictive value) ยังต่ำในกลุ่มประชากรทั่วไป หรืออายุน้อย เมื่อเทียบกับกลุ่มที่มีความเสี่ยงสูง และราคายังค่อนข้างแพง
3. การตรวจด้วย cffDNA เป็นการบอกโอกาสของการตั้งครรภ์นั้น ๆ ว่ามีความเสี่ยงที่ทารกในครรภ์จะมีความผิดปกติของโครโมโซม มากหรือน้อย ไม่สามารถบอกได้ว่าทารกปกติหรือเป็นโรคจริง ๆ
4. การตรวจด้วย cffDNA ยังเป็นเพียงการตรวจคัดกรอง เนื่องจากยังคงมีผลบวกลวง หรือผลลบลวงได้ ดังนั้นไม่สามารถนำมาใช้ทดแทนการตรวจวินิจฉัย ซึ่งถ้าผลเป็นบวกต้องได้รับการยืนยันด้วยการเจาะชิ้นเนื้อรก หรือการเจาะน้ำคร่ำ นอกจากนี้การตรวจวินิจฉัยดังกล่าวจะบอกชนิดของ trisomy ได้(non-disjunction หรือ translocation) ซึ่งจะมีผลต่อการให้ข้อมูลเกี่ยวกับการเกิดเป็นซ้ำในครรภ์ถัดไป
5. การตรวจด้วย cffDNA เป็นการคัดกรองเฉพาะบางโรค คือ trisomy 21, trisomy 18, trisomy 13 อาจรวมโครโมโซมเพศในบางราย ซึ่งไม่สามารถตรวจหาความผิดปกติแบบอื่น ๆ ของทารกในครรภ์ได้ หมายความว่าถ้า cffDNA ให้ผลลบ โอกาสที่จะมีความผิดปกติของโครโมโซมคู่ที่ 21, 18, 13 ลดลง แต่ไม่สามารถบอกได้ว่าทารกในครรภ์ปกติ เพราะอาจมีความผิดปกติของโครโมโซมคู่อื่น หรือมีโครงสร้างร่างกายผิดปกติได้ ทั้งนี้ควรได้รับการอัลตราซาวน์ในไตรมาสที่สอง
6. ร้อยละ 1-5 ของการตรวจด้วย cffDNA ไม่สามารถออกผลได้ (no call, no result) ควรได้รับคำแนะนำและตรวจเพิ่มเติมเนื่องจากเพิ่มความเสี่ยงที่ทารกในครรภ์จะมีความผิดปกติของโครโมโซม
7. ยังไม่แนะนำให้ใช้ cffDNA ในครรภ์แฝด เนื่องจากข้อมูลด้านประสิทธิภาพและความถูกต้องยังมีจำกัด

สรุป

ปัจจุบันการตรวจคัดกรองทารกที่มีความผิดปกติของโครโมโซมที่พบบ่อย โดยวิธีการตรวจสารพันธุกรรมทารกในเลือดมารดา เริ่มมีการนำมาใช้มากขึ้น ประกอบกับมีการให้บริการของหลายบริษัทที่มีการแข่งขันกันสูง ทำให้ข้อมูลเหล่านี้เข้าถึงผู้รับบริการได้ง่าย อย่างไรก็ตามในฐานะแพทย์ และผู้ให้บริการทางสาธารณสุข ควรมีความรู้ความเข้าใจที่ถูกต้องเกี่ยวกับการตรวจด้วยวิธีนี้ เพื่อที่จะสามารถให้คำปรึกษาทางพันธุศาสตร์ได้ โดยเฉพาะข้อมูลเกี่ยวกับความสามารถของวิธีตรวจ ข้อจำกัด รวมถึงโอกาสเกิดผลบวกลวงหรือ ผลลบลวง ดังนั้นการติดตามและทบทวนความรู้ให้ทันสมัยอยู่เสมอ ก็จะเป็นประโยชน์ในการดูแลให้คำแนะนำแก่สตรีตั้งครรภ์และครอบครัวได้อย่างเหมาะสมต่อไป

เอกสารอ้างอิง

1. Ashoor G, Syngelaki A, Poon LC, Rezende JC, Nicolaides KH. Fetal fraction in maternal plasma cell-free DNA at 11-13 weeks’ gestation: relation to maternal and fetal characteristics. Ultrasound Obstet Gynecol 2013;41:26-32.

2. Lui YY, Chik KW, Chiu RW, Ho CY, Lam CW, Lo YM. Predominant hematopoietic origin of cell-free DNA in plasma and serum after sex-mismatched bone marrow transplantation. Clin Chem 2002;48:421-7.

3. Sekizawa A, Samura O, Zhen DK, Falco V, Farina A, Bianchi DW. Apoptosis in fetal nucleated erythrocytes circulating in maternal blood. Prenat Diagn 2000;20:886-9.

4. Tjoa ML, Cindrova-Davies T, Spasic-Boskovic O, Bianchi DW, Burton GJ. Trophoblastic oxidative stress and the release of cell-free feto-placental DNA. Am J Pathol 2006;169:400-4.

5. Guibert J, Benachi A, Grebille AG, Ernault P, Zorn JR, Costa JM. Kinetics of SRY gene appearance in maternal serum: detection by real time PCR in early pregnancy after assisted reproductive technique. Hum Reprod 2003;18:1733-6.

6. Lo YM, Zhang J, Leung TN, Lau TK, Chang AM, Hjelm NM. Rapid clearance of fetal DNA from maternal plasma. Am J Hum Genet 1999;64:218-24.

7. Yu SC, Lee SW, Jiang P, Leung TY, Chan KC, Chiu RW, et al. High-resolution profiling of fetal DNA clearance from maternal plasma by massively parallel sequencing. Clin Chem 2013;59:1228-37.

8. Wang E, Batey A, Struble C, Musci T, Song K, Oliphant A. Gestational age and maternal weight effects on fetal cell-free DNA in maternal plasma. Prenat Diagn 2013;33:662-6.

9. Canick JA, Palomaki GE, Kloza EM, Lambert-Messerlian GM, Haddow JE. The impact of maternal plasma DNA fetal fraction on next generation sequencing tests for common fetal aneuploidies. Prenat Diagn 2013;33:667-74.

10. Palomaki GE, Kloza EM, Lambert-Messerlian GM, van den Boom D, Ehrich M, Deciu C, et al. Circulating cell free DNA testing: are some test failures informative? Prenat Diagn 2015;35:289-93.

11. Pergament E, Cuckle H, Zimmermann B, Banjevic M, Sigurjonsson S, Ryan A, et al. Single-nucleotide polymorphism-based noninvasive prenatal screening in a high-risk and low-risk cohort. Obstet Gynecol 2014;124:210-8.

12. Gil MM, Quezada MS, Revello R, Akolekar R, Nicolaides KH. Analysis of cell-free DNA in maternal blood in screening for fetal aneuploidies: updated meta-analysis. Ultrasound Obstet Gynecol 2015;45:249-66.

13. Committee Opinion No. 640: Cell-free DNA Screening for Fetal Aneuploidy. Obstet Gynecol 2015.

14. Kalousek DK, Vekemans M. Confined placental mosaicism. J Med Genet 1996;33:529-33.

15. Curnow KJ, Wilkins-Haug L, Ryan A, Kirkizlar E, Stosic M, Hall MP, et al. Detection of triploid, molar, and vanishing twin pregnancies by a single-nucleotide polymorphism-based noninvasive prenatal test. Am J Obstet Gynecol 2015;212:79-.

16. Wang Y, Chen Y, Tian F, Zhang J, Song Z, Wu Y, et al. Maternal mosaicism is a significant contributor to discordant sex chromosomal aneuploidies associated with noninvasive prenatal testing. Clin Chem 2014;60:251-9.

17. Bianchi DW, Chudova D, Sehnert AJ, Bhatt S, Murray K, Prosen TL, et al. Noninvasive Prenatal Testing and Incidental Detection of Occult Maternal Malignancies. JAMA 2015;314:162-9.

18. Snyder MW, Simmons LE, Kitzman JO, Coe BP, Henson JM, Daza RM, et al. Copy-number variation and false positive prenatal aneuploidy screening results. N Engl J Med 2015;372:1639-45.

19. Bianchi DW, Parsa S, Bhatt S, Halks-Miller M, Kurtzman K, Sehnert AJ, et al. Fetal sex chromosome testing by maternal plasma DNA sequencing: clinical laboratory experience and biology. Obstet Gynecol 2015;125:375-82.

20. Norton ME, Jelliffe-Pawlowski LL, Currier RJ. Chromosome abnormalities detected by current prenatal screening and noninvasive prenatal testing. Obstet Gynecol 2014;124:979-86.

21. Norton ME, Jacobsson B, Swamy GK, Laurent LC, Ranzini AC, Brar H, et al. Cell-free DNA analysis for noninvasive examination of trisomy. N Engl J Med 2015;372:1589-97.

22. Practice Bulletin No. 163: Screening for Fetal Aneuploidy. Obstet Gynecol 2016;127:e123-e37.