Assisted reproductive technology: general knowledge, preparation for couple
ความรู้ทั่วไปเกี่ยวกับการใช้เทคโนโลยีช่วยการเจริญพันธุ์ และการเตรียมตัวสำหรับคู่สมรส

นพ. สันติภาพ ศรีสมบูรณ์/
อาจารย์ที่ปรึกษา อ.พญ. อุษณีย์ แสนหมี่

---

ภาวะมีบุตรยาก เป็นภาวะที่สำคัญ และเป็นปัญหาสำหรับคู่สมรส ทั้งด้านร่างกาย จิตใจ ครอบครัว ซึ่งในปัจจุบันมีแนวทางการประเมินสาเหตุ และการรักษา รวมถึงการใช้เทคโนโลยีช่วยการเจริญพันธุ์ ทำให้คู่สมรสที่มีบุตรยาก มีโอกาสที่จะมีบุตรได้มากขึ้น นอกจากนี้การใช้เทคโนโลยีช่วยการเจริญพันธุ์ยังสามารถใช้ในการวินิจฉัยโรคที่ถ่ายทอดทางพันธุกรรม ก่อนที่จะทำการฝังตัวของตัวอ่อนได้

นิยาม

ภาวะมีบุตรยาก (infertility) หมายถึง การที่คู่สมรสไม่ตั้งครรภ์หลังจากมีเพศสัมพันธ์อย่างสม่ำเสมอโดยไม่คุมกำเนิด เป็นเวลา 1 ปี แบ่งออกเป็น 2 ชนิดคือ

1. ภาวะมีบุตรยากแบบปฐมภูมิ (primary infertility) คือการที่คู่สมรสไม่เคยตั้งครรภ์มาก่อน
2. ภาวะมีบุตรยากแบบทุติยภูมิ (secondary infertility) คือการที่คู่สมรสเคยตั้งครรภ์มาก่อนแล้ว แต่ไม่สามารถตั้งครรภ์ได้อีกทั้ง ๆ ที่พยายามแล้ว เป็นเวลา 1 ปี

Subfertility หมายถึง คู่สมรสที่ตั้งครรภ์ หลังจากมีเพศสัมพันธ์อย่างสม่ำเสมอโดยไม่คุมกำเนิด โดยใช้เวลา มากกว่า 1 ปี

Fecundability หมายถึง โอกาสตั้งครรภ์ใน 1 รอบเดือน โดยทั่วไป ประมาณร้อยละ 20 ในคู่สมรสปกติ

Fecundity หมายถึง โอกาสตั้งครรภ์ และคลอดทารกที่มีชีวิตใน 1 รอบเดือน

อุบัติการณ์ของภาวะมีบุตรยาก

ปัจจุบัน พบว่ามีอุบัติการณ์ที่มากขึ้นเนื่องจากคู่สมรสมีอายุมากขึ้น ในสตรีที่อายุมากกว่า 30 ปี โอกาสเกิดการตั้งครรภ์ที่สำเร็จจะลดลงตามอายุที่มากขึ้น ในสหรัฐอเมริกาพบจำนวนคู่สมรสร้อยละ 21 ที่ประสบปัญหามีบุตรยาก และพบความชุกของการมีบุตรยากได้ถึงร้อยละ 7.4 นอกจากนี้ยังพบว่าสตรีกว่า 7 ล้านคนในช่วงอายุ 22 ถึง 44 ปี ได้รับการใช้บริการที่เกี่ยวเนื่องกับการมีบุตรยาก {3}

สาเหตุของภาวะมีบุตรยาก

ภาวะมีบุตรยากเกิดได้จากทั้งฝ่ายชาย และฝ่ายหญิง โดยเกิดจากฝ่ายชาย ร้อยละ 20-30 ฝ่ายหญิง ร้อยละ 40-55 เกิดจากสาเหตุร่วมทั้ง 2 ฝ่าย ร้อยละ 10-40 และ ไม่ทราบสาเหตุ ร้อยละ 10-20{3}

สาเหตุของฝ่ายชายเริ่มตั้งแต่ กระบวนการสร้างผิดปกติ การขนส่งอสุจิ การร่วมเพศ การหลั่งของน้ำเชื้อ ความสามารถในการเข้าไปปฏิสนธิกับไข่ แต่ละขั้นตอนเกิดความผิดปกติได้หลายชนิด

สาเหตุของฝ่ายหญิงเกิดจากความผิดปกติของไข่และการตกไข่ ซึ่งเกี่ยวข้องกับฮอร์โมนจากต่อมใต้สมอง และเกิดจากความผิดปกติของอวัยวะสืบพันธุ์ ได้แก่ ท่อนำไข่ มดลูก ปากมดลูก ช่องคลอด ได้

 

สาเหตุของภาวะมีบุตรยาก (ร้อยละ)
ฝ่ายชาย	20 – 30
ฝ่ายหญิง	40 – 55
ทั้ง 2 ฝ่าย	10 – 40
ไม่ทราบสาเหตุ	10 – 20
สาเหตุของภาวะมีบุตรยากในฝ่ายหญิงโดยประมาณ (ร้อยละ)
ความผิดปกติของการตกไข่	20 – 40
ความผิดปกติของท่อนำไข่ และอุ้งเชิงกราน	20 – 40
สาเหตุอื่น ๆ เช่นความผิดปกติของมดลูก และปากมดลูก	10 – 15

ตารางที่ 1 สาเหตุของภาวะมีบุตรจาก (ดัดแปลงจาก Berek & Novak’s Gynecology, 15th edition)[3]

การประเมินภาวะมีบุตรยากจากคู่สมรส

ควรทำการประเมินร่วมกันทั้งฝ่ายหญิง และฝ่ายชาย โดยเริ่มจากการ ซักประวัติของฝ่ายหญิง ได้แก่ ประวัติทางนรีเวช ประวัติโรคประจำตัว และการผ่าตัด ประวัติรอบเดือน และอาการปวดประจำเดือน รวมถึงการปวดท้องน้อย ประวัติโรคติดเชื้อในอุ้งเชิงกราน ประวัติการได้รับสาร Diethylstilbestrol (DES) ขณะอยู่ในครรภ์มารดา ประวัติโรคทางระบบต่อมไร้ท่อ

ประวัติของฝ่ายชาย ได้แก่ ประวัติการผ่าตัด หรืออุบัติเหตุเกี่ยวกับอวัยวะเพศ ประวัติการติดเชื้อ เช่น คางทูม ประวัติโรคประจำตัวและการใช้ยาต่าง ๆ

ประวัติการมีเพศสัมพันธ์ของทั้ง 2 ฝ่าย ลักษณะการหลั่ง อาการปวดขณะมีเพศสัมพันธ์ และความผิดปกติขณะมีเพศสัมพันธ์

ประวัติโรคถ่ายทอดทางพันธุกรรมของทั้ง 2 ฝ่าย

ทำการตรวจร่างกายทั่วไป ตรวจภายในของฝ่ายหญิง ตรวจดูลักษณะอวัยวะเพศ ลักษณะการเจริญทางเพศ ตรวจคัดกรองมะเร็งปากมดลูก และตรวจดูถุงอัณฑะของฝ่ายชาย เพื่อดูความผิดปกติที่สามารถพบเจอได้

พิจารณาส่งตรวจเบื้องต้นเพื่อใช้ในการประเมินและการรักษาคู่สมรสที่มีบุตรยาก ได้แก่

1. การตรวจวิเคราะห์น้ำอสุจิ (semen analysis)
2. การประเมินภาวะการตกไข่ของสตรี เพื่อยืนยันว่ามีการตกไข่จริง
3. ส่งตรวจเพิ่มเติม เพื่อประเมินท่อนำไข่ และพยาธิสภาพอื่น ๆ ในอุ้งเชิงกรานของสตรี

หากการส่งตรวจเบื้องต้น ตรวจพบสาเหตุที่ทำให้เกิดภาวะมีบุตรยาก ก็สามารถทำการแก้ไขได้ตามแต่ละสาเหตุต่อไป การใช้เทคโนโลยีช่วยการเจริญพันธุ์ ก็เป็นอีกวิธีหนึ่ง ที่จะช่วยให้คู่สมรสสามารถตั้งครรภ์ได้

นอกจากนี้ ควรเจาะเลือดพื้นฐาน เพื่อเตรียมความพร้อมสำหรับการตั้งครรภ์ ในฝ่ายหญิง ได้แก่ค่าความเข้มข้นของเลือด การตรวจการติดเชื้อไวรัสตับอักเสบบี ซิฟิลิส HIV หมู่เลือด และ หมู่ Rh การตรวจคัดกรองคู่เสี่ยงโรคเลือดจางธาลัสซีเมีย รวมถึงการตรวจหาภูมิคุ้มกันต่อโรคหัดเยอรมัน (Rubella IgG) และในฝ่ายชายได้แก่ การตรวจการติดเชื้อ HIV

การตรวจวิเคราะห์น้ำอสุจิ

เป็นการตรวจที่ง่ายและไม่มีอันตราย องค์การอนามัยโลก(WHO) แนะนำให้ฝ่ายชายงดการหลั่งอสุจิเป็นเวลาอย่างน้อย 2 วัน แต่ไม่เกิน 7 วันก่อนการตรวจ ควรเก็บน้ำอสุจิมาตรวจด้วยวิธีการช่วยตัวเอง ไม่แนะนำให้เก็บโดยวิธีการร่วมเพศแล้วใช้การหลั่งนอก เนื่องจากปริมาณน้ำอสุจิจากส่วนต่าง ๆ ภายในร่างกายมีความเข้มข้นไม่เท่ากัน (ส่วนแรกจากหลอดเก็บน้ำอสุจิและต่อมลูกหมาก มีความเข้มข้นสูง ส่วนท้ายที่มาจากต่อมสร้างน้ำเลี้ยงอสุจิมีความเข้มข้นต่ำ) มีความผันแปรได้ในน้ำอสุจิที่ได้มาในเวลาต่างกัน ดังนั้นจึงควรทำอย่างน้อย 2 ครั้งจึงจะสรุปได้ว่ามีความผิดปกติโดยเก็บห่างจากครั้งแรกไม่ต่ำกว่า 7 วัน อสุจิที่เก็บตรวจควรส่งตรวจถึงห้องปฏิบัติการภายใน 1 ชั่วโมง และหลีกเลี่ยงไม่ให้อสุจิถูกความเย็น ความร้อน หรือตากแดด

 

ลักษณะ	ปริมาณ
ปริมาตร	≥ 1.5 มิลลิลิตร
pH	7.2 – 7.8
ความเข้มข้นของตัวอสุจิ	≥15 ล้านตัว/มิลลิลิตร
จำนวนตัวอสุจิทั้งหมด	≥ 39 ล้านตัว
รูปร่างปกติ	≥ 4% (อาศัยเกณฑ์ strict, Tygerberg method)
ตัวอสุจิมีชีวิต	≥ 58%
การเคลื่อนไหว	เคลื่อนไหวไปข้างหน้า (progressive) > 32%
การเคลื่อนไหวทั้งหมด	≥ 40%
จำนวนเม็ดเลือดขาว	น้อยกว่า 1 ล้านตัว/มิลลิลิตร
Immunobead test หรือ mixed antiglobulin reaction test	< 50%

ตารางที่ 2 ค่าปกติของน้ำอสุจิ (องค์การอนามัยโลก; WHO 2010)

หากการตรวจวิเคราะห์น้ำอสุจิมีความผิดปกติ จะต้องหาสาเหตุของความผิดปกติเพิ่มเติม ร่วมกับการตรวจร่างกายอย่างละเอียดต่อไป ในกรณีที่ไม่มีอสุจิในน้ำเชื้อเนื่องจากการอุดตันของท่อน้ำเชื้อหรือสาเหตุอื่นที่ไม่ใช่เกิดจากการที่อัณฑะไม่สามารถสร้างอสุจิ อาจใช้วิธีการเก็บอสุจิจากการผ่าตัดบริเวณเฉพาะที่ได้ แต่ในรายที่ฝ่ายชายมีความผิดปกติที่อัณฑะไม่สามารถสร้างอสุจิได้ ก็อาจจะต้องใช้อสุจิจากผู้บริจาค

การประเมินภาวะการตกไข่ของสตรี

การที่ฝ่ายหญิงไม่ตกไข่ จัดเป็นสาเหตุของการมีบุตรยากได้ร้อยละ 20 – 40 โดยทั่วไปในสตรีที่ตกไข่ทุกเดือน การมีเพศสัมพันธ์ 2-3 ครั้งต่อสัปดาห์ มักจะทำให้อยู่ในช่วงเวลาที่พอดีของการตกไข่ และไข่มาผสมกับอสุจิได้ อสุจิสามารถอยู่ในช่องคลอดได้ถึง 6 วันหากมีมูกปากมดลูกที่เหมาะสม

การประเมินการตกไข่ทำได้โดย

1. การบันทึกอุณหภูมิกาย(basal body temperature: BBT): ให้วัดอุณหภูมิทางปากทุกวัน ในช่วงตื่นนอนตอนเช้าก่อนลุกจากเตียง เริ่มตั้งแต่วันแรกที่มีประจำเดือนมา หลังการตกไข่จะมีอุณหภูมิร่างกายสูงขึ้น 0.5 – 1 oF คาดคะเนว่าการตกไข่เกิดขึ้นประมาณ 3 วันก่อนที่อุณหภูมิจะสูงขึ้น ข้อเสียของวิธีนี้คือใช้ทำนายการตกไข่ไม่ได้ แต่มีประโยชน์ในการมองย้อนหลัง การวัดอุณหภูมิที่ไม่ถูกต้องอาจทำให้ค่าแปรปรวนได้
2. การตรวจมูกปากมดลูก: ในช่วงตกไข่จะมูกใส ๆ ปริมาณมาก ปากมดลูกจะนุ่มและเปิดออก มูกสามารถยืดให้ยาวได้(spinnbarkeit) และเมื่อทิ้งให้แห้งจะตกผลึกเป็นรูปเฟิร์น หลังตกไข่แล้วปากมดลูกจะปิดและแข็ง มูกมีลักษณะแห้งข้น
3. การตรวจ LH surge ในปัสสาวะ: หลัง LH surge ภายใน 2 ชั่วโมง จะสามารถตรวจพบ LH ในปัสสาวะได้ ดังนั้นการใช้ชุดตรวจ LH ในปัสสาวะ สามารถทำได้ง่ายและสะดวก เชื่อว่าหาก LH surge แล้ว ภายใน 48 ชั่วโมงจะมีการตกไข่เกิดขึ้น
4. การตรวจดูระดับโปรเจสเตอโรนในช่วง midluteal (หลังตกไข่): ระดับโปรเจสเตอโรนในช่วงวันที่ 21-23 ของรอบเดือนจะสูงขึ้นหลังการตกไข่ หากค่าสูงมากกว่า 3 ng/mL จะช่วยยืนยันการตกไข่ได้ แต่หากค่าต่ำกว่า 3 ng/mL ไม่ได้บอกถึงว่าไม่มีการตกไข่
5. การตรวจด้วยคลื่นเสียงความถี่สูง: การตรวจทางช่องคลอด ในช่วงก่อนตกไข่แล้วเห็นฟองไข่ขนาด 17-19 mm แล้วติดตามการตรวจซ้ำ เห็นขนาดฟองไข่ที่ลดลง ช่วยบ่งบอกการตกไข่ได้

หากไม่มีการตกไข่ ควรตรวจหาสาเหตุเพิ่มเติม โดยการส่งตรวจ ระดับ FSH, prolactin และ TSH และในรายที่สตรีมีอายุมาก ควรประเมินปริมาณไข่ที่เหลือ เช่นการส่งตรวจระดับ AMH รวมถึง antral follicle count ร่วมด้วย

การประเมินท่อนำไข่และอุ้งเชิงกราน

การทดสอบการอุดตันของท่อนำไข่เป็นการประเมินเบื้องต้นถึงสาเหตุของการมีบุตรยากได้ ในรายที่มีประวัติการติดเชื้อในอุ้งเชิงกราน หรืออุ้งเชิงกรานอักเสบสามารถส่งผลให้ท่อนำไข่ผิดปกติได้ สามารถประเมินได้โดยวิธีดังนี้ การฉีดสีดูท่อนำไข่และโพรงมดลูก(hysterosalpingography:HSG) การตรวจด้วยคลื่นเสียงความถี่สูง(ultrasonography) การส่องกล้องตรวจในโพรงมดลูก(hysteroscopy) และ การเจาะท้องส่องกล้อง(diagnostic laparoscopy)

เทคโนโลยีช่วยการเจริญพันธุ์

เทคโนโลยีช่วยการเจริญพันธุ์ หมายถึงกรรมวิธีที่ช่วยให้มีการตั้งครรภ์เกิดขึ้น โดยนำเซลล์สืบพันธ์ของทั้งฝ่ายชาย และฝ่ายหญิง ได้แก่ อสุจิ และไข่ ออกจากร่างกาย และนำมาใส่ในท่อนำไข่ หรือโพรงมดลูก หรือทำให้ปฏิสนธินอกร่างกาย แล้วค่อยย้ายตัวอ่อนกลับเข้าไปในโพรงมดลูก วิธีที่ได้ยินกันบ่อย ๆ และใช้กันบ่อย ๆ ในปัจจุบัน ได้แก่

1. IVF (in vitro fertilization) หรือการทำเด็กหลอดแก้ว คือการนำไข่และอสุจิมาผสมให้เกิดการปฏิสนธิในห้องทดลอง จากนั้นจึงนำตัวอ่อนที่เกิดขึ้น ใส่กลับเข้าไปในมดลูกผ่านปากมดลูกเข้าไปฝังตัวในเยื่อบุโพรงมกลูก
2. ICSI (Intracytoplasmic sperm injection) คือการฉีดเชื้ออสุจิเพียง 1 ตัวเข้าไปในไข่ (Ooplasm) ใช้ในกรณีที่อสุจิของฝ่ายชายมีปริมาณและลักษณะที่ผิดปกติ ไม่สามารถผสมกับไข่เองได้
3. GIFT (gamete intrafallopian transfer) คือการนำไข่(หลายใบจากการกระตุ้น)และอสุจิ ใส่กลับเข้าไปในท่อนำไข่ข้างใดข้างหนึ่ง หรือทั้ง 2 ข้างโดยให้ไข่และอสุจิผสมกันเป็นตัวอ่อนและฝังตัวในโพรงมดลูก เชื่อว่าเป็นวิธีที่เลียนแบบธรรมชาติ การย้ายไข่และอสุจิเข้าไปในท่อนำไข่ จะต้องทำโดยการเจาะท้องส่องกล้องซึ่งเจ็บตัว และผู้ที่จะใช้วิธีนี้ได้จะต้องมีท่อนำไข่ที่ดี
4. ZIFT (zygote intrafallopian transfer) คือการย้ายตัวอ่อนระยะเซลล์เดียว เข้าไปในท่อนำไข่ เพื่อให้มีการฝังตัวในโพรงมดลูก
5. Cryopreserved embryo transfers คือการย้ายตัวอ่อนที่เก็บตัวอ่อนไว้

ปัจจุบัน การทำ IVF เป็นที่นิยมมากกว่า GIFT และ ZIFT เนื่องจากอัตราการตั้งครรภ์ไม่แตกต่างกัน การทำ GIFT อาจเหมาะกับคู่สมรสบางรายตามความเชื่อทางศาสนาเพราะการปฏิสนธิเกิดขึ้นภายในร่างกาย

ข้อบ่งชี้ของการใช้เทคโนโลยีช่วยการเจริญพันธุ์

การใช้เทคโนโลยีช่วยการเจริญพันธุ์ ปัจจุบันที่นิยมได้แก่การทำเด็กหลอดแก้ว หรือ IVF โอกาสสำเร็จของการทำ IVF ขึ้นกับอายุมารดาเป็นหลัก พบว่ามารดาที่อายุมากขึ้นมีโอกาสตั้งครรภ์สำเร็จลดลง และมีการแท้งบุตรที่มากขึ้น การทำ IVF มีข้อบ่งชี้ต่าง ๆ ดังนี้

1. คู่สมรสที่มีบุตรยากจากสาเหตุของท่อนำไข่(tubal factor infertility): ท่อนำไข่ส่วนปลายที่ตันเล็กน้อย อาจสามารถรักษาด้วยการผ่าตัดแก้ไขได้ แต่สำหรับท่อนำไข่ส่วนปลายที่ตันแบบรุนแรง และไม่สามารถทำการแก้ไขได้ การทำเด็กหลอดแก้วจัดเป็นการรักษาที่เหมาะสม ในรายที่ตรวจพบท่อนำไข่ส่วนต้นตันนั้น อาจเกิดจากการตรวจ HSG ที่ผิดจากท่อนำไข่ส่วนต้นหดเกร็ง(cornual spasm) ได้ ซึ่งจะต้องทำการตรวจเพิ่มเติมอื่น ๆ แต่หากยังไม่สามารถตั้งครรภ์ภายใน 6-12 เดือน การทำเด็กหลอดแก้วก็เหมาะสม และในรายที่จำเป็นที่จะต้องทำเด็กหลอดแก้วนั้น การตัดท่อนำไข่ทั้ง 2 ข้างออกกรณีที่ท่อนำไข่โป่งพองเป็นถุงน้ำ ก่อนทำการย้ายตัวอ่อน ช่วยให้การตั้งครรภ์สำเร็จได้มากขึ้นถึง 2 เท่า
2. เยื่อบุโพรงมดลูกเจริญผิดที่(endometriosis) รวมถึง chocolate cyst: เยื่อบุโพรงมดลูกเจริญผิดที่สามารถทำให้เกิดพังผืดที่ส่งผลให้อวัยวะต่าง ๆ อยู่ในรูปร่างที่ผิดปกติ และลดการสร้างไข่ที่ปกติได้ การผ่าตัดแก้ไขภาวะเยื่อบุโพรงมดลูกเจริญผิดที่ สามารถช่วยให้การตั้งครรภ์เกิดขึ้นได้เอง แต่การทำเด็กหลอดแก้วก็เป็นอีกวิธีหนึ่งที่ทำให้เกิดการตั้งครรภ์ได้ ทางเลือกในการรักษาขึ้นกับแต่ละบุคคล ผลสำเร็จหลังการผ่าตัด ความรุนแรงของโรค และอายุของสตรี
3. คู่สมรสที่มีบุตรยากจากสาเหตุของฝ่ายชาย(male factor infertility): ในรายที่น้ำเชื้อของฝ่ายชายมีความผิดปกติ รวมถึงการรักษาด้วยวิธีการฉีดน้ำเชื้อเข้าโพรงมดลูก(IUI) แล้วยังไม่ตั้งครรภ์ การเตรียมน้ำเชื้อสำหรับการทำเด็กหลอดแก้วโดยทำให้น้ำเชื้อมีความเข้มข้นมากขึ้น และผสมกับไข่ มีโอกาสทำให้เกิดการตั้งครรภ์ได้ แต่ในรายที่น้ำเชื้อมีความเข้มข้นของตัวอสุจิน้อยมาก(น้อยกว่า 5 ล้านตัว/มิลลิลิตร) ควรใช้วิธี ICSI
4. คู่สมรสที่มีบุตรยากจากสาเหตุของการตกไข่(ovulatory dysfunction): ปัญหาของการไม่ตกไข่ เช่น ภาวะ hypogonadotropic hypogonadism, polycystic ovary syndrome, โรค thyroid, โรคฮอร์โมนโปรแลกตินสูง เป็นต้น ส่งผลให้มีบุตรยากได้ การรักษาโดยการทำเด็กหลอดแก้ว สามารถใช้ยาช่วยกระตุ้นให้ตกไข่ และตั้งครรภ์ได้
5. คู่สมรสที่มีบุตรยากแบบไม่ทราบสาเหตุ(Unexplained infertility): ในคู่สมรสที่ไม่ทราบสาเหตุ อาจใช้การทำเด็กหลอดแก้วเพื่อช่วยให้ตั้งครรภ์ได้
6. มีบุตรยากจากรังไข่ล้มเหลว และไข่เหลือน้อย(ovarian failure and diminished ovarian reserve): ในรายที่ปริมาณรังไข่เหลือน้อย ที่อายุมากกว่า 42 ปี สามารถใช้รังไข่ที่ได้จากการบริจาคเพื่อทำเด็กหลอดแก้ว และช่วยให้ตั้งครรภ์ได้
7. ข้อบ่งชี้อื่น ๆ ที่จำเป็นจะต้องใช้เทคโนโลยีช่วยการเจริญพันธุ์ เช่นผู้ป่วยมะเร็งที่จะต้องได้รับการรักษาด้วยยาเคมีบำบัด และการฉายแสง สามารถเก็บไข่ไว้ก่อนการรักษาได้ หรือในรายที่มีโรคประจำตัวที่รุนแรง ไม่สามารถตั้งครรภ์ได้ อาจเก็บไข่ และทำเด็กหลอดแก้ว แล้วย้ายตัวอ่อนให้แม่อุ้มบุญ ซึ่งกรณีนี้ยังเป็นที่ถกเถียงกันทางด้านจริยธรรม

หลักการของการทำ IVF

1. ป้องกันไม่ให้เกิดการตกไข่(Prevention of a premature LH surge): ทำได้โดยการให้ GnRH agonists หรือ GnRH antagonists ซึ่งเป็นการใช้ยาที่มีสูตรโครงสร้างเลียนแบบ GnRH ซึ่งเป็น hormone ที่กระตุ้นให้เกิดการสร้าง FSH และ LH แต่การให้ยา GnRH agonists หรือ GnRH antagonists จะมีผลยับยั้งไม่ให้มีการสร้าง FSH และ LH โดยธรรมชาติ ซึ่งจะป้องกัน premature LH surge ไม่ให้เกิดการตกไข่ก่อนเวลาที่จะเก็บไข่
2. กระตุ้นการเจริญของฟองไข่(Follicle growth): ทำได้โดยการให้ยากลุ่ม gonadotropins เป็นฮอร์โมน FSH จากภายนอก (exogenous FSH) ซึ่งได้แก่ urinary FSH, recombinant FSH, และ urinary menotropins โดยการให้ยานี้จะทำให้มีการเจริญของฟองไข่เกิดขึ้น
3. การเตรียมตัวก่อนเข้าสู่การทำ IVF (Pretreatment): เป็นการให้ยาเม็ดคุมกำเนิด เพื่อช่วยคุมรอบเดือนและกำหนดวันที่จะเริ่มยาที่ป้องกันไม่ให้เกิดการตกไข่ได้อย่างเหมาะสม และยังช่วยลดการสร้างถุงน้ำรังไข่ได้
4. 4. การใช้ยาเพิ่มเติมเพื่อช่วยการทำ IVF (Adjunctive medications): สามารถให้วิตามินบำรุงครรภ์ เช่น folate ได้ รวมถึงให้ยาฆ่าเชื้อได้แก่ doxycycline หรือ azithromycin ในคู่สมรส เพื่อลดเชื้อก่อโรคเฉพาะที่ และอาจให้ยาเพิ่มเติมในกลุ่มเฉพาะโรค เช่น glucocorticoids ในกลุ่ม autoimmune, metformin ในกลุ่ม PCOS
5. กระตุ้นให้ตกไข่และเจริญโดยสมบูรณ์ (Oocyte maturation/ovulation triggering): เนื่องจาก GnRH agonists หรือ GnRH antagonists ที่ได้ไปนั้นมีผลยับยั้ง FSH และ LH ของร่างกาย ฟองไข่ที่เกิดขึ้นเจริญจาก exogenous FSH แต่ฟองไข่ตามปกติที่เจริญตามธรรมชาตินั้นต้องอาศัย LH เพื่อให้เจริญโดยสมบูรณ์ จึงมีการใช้ hCG 5,000-10,000 IU IM ซึ่งมีโครงสร้างคล้าย LH เพื่อทำให้ฟองไข่เจริญอย่างสมบูรณ์และพร้อมต่อการเก็บไข่ต่อไป จะให้ hCG เมื่อมีการเจริญของฟองไข่ขนาด 17-18 mm (แต่ไม่เกิน 24 mm) จำนวนอย่างน้อย 3 ฟอง และเยื่อบุโพรงมดลูก หนามากกว่าหรือเท่ากับ 8 mm
6. เก็บไข่(Oocyte retrieval): โดยทั่วไปทำหลังจากให้ hCG แล้ว 36-37 ชั่วโมง ทำโดยการใช้เข็มเบอร์ 16-17 เข้าไปเก็บไข่แต่ละใบโดยการดูดไข่ออกมา ร่วมกับการใช้คลื่นเสียงความถี่สูงทางช่องคลอดช่วยเล็งตำแหน่งไข่ ก่อนทำการเก็บไข่จะต้องให้ยาที่ทำให้ผู้ป่วยซึมหลับไปก่อน และให้ยาฆ่าเชื้อเป็น ceftriaxone 2 gm iv ร่วมด้วย การทำความสะอาดภายในช่องคลอดก่อนการเก็บไข่ใช้การล้างด้วยน้ำเกลืออย่างเดียว ภายหลังการเก็บไข่อาจมีเลือดออกจากจุดที่แทงเข็มได้ ซึ่งหยุดได้ด้วยการกดบริเวณที่เลือดออกไว้ ในรายที่รุนแรงสามารถเกิดก้อนเลือดคั่ง(hematoma) จากการที่เข็มไปโดนหลอดเลือดแดง uterine artery และ ovarian artery ได้ ซึ่งเกิดได้ค่อนข้างน้อย การติดเชื้อในอุ้งเชิงกรานตามหลังการเก็บไข่นั้นเกิดน้อย
7. ให้ฮอร์โมนช่วยในช่วงหลังเก็บไข่ (Luteal support): มีการให้ฮอร์โมนโปรเจสเตอโรนช่วยภายหลังการเก็บไข่ โดยอาจจะให้หลังให้ hCG 3-4 วัน ไม่เกินช่วงภายใน 5 วันหลังเก็บไข่ ซึ่งสามารถให้ในรูปแบบ ยากิน ยาฉีดกล้ามเนื้อ หรือยาสอดช่องคลอดก็ได้ และให้ไปจนอายุครรภ์ 8-9 สัปดาห์ เนื่องจากการให้ GnRH agonist หรือ antagonist จะยับยั้ง LH ของร่างกาย ทำให้ไม่เพียงพอต่อการสร้าง corpus luteum ตามปกติ ซึ่ง corpus luteum จะสร้างโปรเจสเตอโรนตามธรรมชาติ และช่วยให้การตั้งครรภ์ดำเนินไปได้ ดังนั้นจึงต้องให้ฮอร์โมนโปรเจสเตอโรนเพื่อช่วยให้การตั้งครรภ์ที่เกิดจากการทำเด็กหลอดแก้วดำเนินไปตามปกติ
8. ผสมตัวอ่อน (Fertilization by IVF or ICSI): หลังจากเก็บน้ำเชื้อ และไข่แล้ว น้ำเชื้อจะถูกเพาะเลี้ยงเพื่อกระตุ้นการสร้างประจุเป็นเวลา 3-4 ชั่วโมง เพื่อให้น้ำเชื้อสามารถนำไปใช้ได้ และมีการทำให้ความเข้มข้นของน้ำเชื้อรวมถึงจำนวนอสุจิที่มีการเคลื่อนไหวมีความเข้มข้นมากขึ้น จากนั้นทำการผสมเด็กหลอดแก้วโดยนำน้ำเชื้อที่มีความเข้มข้นสูง ฉีดเข้าสู่กลุ่มไข่หลาย ๆ ใบที่เก็บมาได้ และรอให้มีการผสมของอสุจิและไข่ต่อไป ในรายที่อสุจิมีความผิดปกติ เช่นไม่มีการเคลื่อนไหว หรือจำนวนอสุจิน้อยมาก จะใช้การทำ ICSI ซึ่งจะเป็นการฉีดอสุจิเข้าไปผสมภายในไข่โดยตรง
9. เพาะเลี้ยงตัวอ่อน (In vitro embryo culture): ภายหลังการผสมของไข่และอสุจิแล้ว จะได้ลักษณะของตัวอ่อนที่เปลี่ยนแปลงไปโดยมี 2 pronuclei และ second polar body ตัวอ่อนที่มีการเปลี่ยนแปลงจะถูกนำมาเพาะเลี้ยงต่อจนเข้าสู่ระยะ blastocyst ซึ่งจะอยู่ที่ประมาณวันที่ 5 หรือ 6 ซึ่งตัวอ่อนในระยะ blastocyst จะใช้สำหรับการย้ายตัวอ่อนเข้าสู่โพรงมดลูก หรือจะใช้ตัวอ่อนในระยะ cleavage-stage embryos ซึ่งจะอยู่ที่ประมาณวันที่ 3 ในการย้ายตัวอ่อนเข้าสู่โพรงมดลูกได้
10. ย้ายตัวอ่อน (Transfer of fresh embryos): ตัวอ่อนที่ได้จะทำการแยกและแบ่งตามคุณภาพ และลักษณะการเจริญเติบโตที่เหมาะสมของตัวอ่อน แล้วจึงค่อยทำการย้ายตัวอ่อน โดยทั่วไปจะย้ายตัวอ่อนเพียงตัวเดียว เนื่องจากการตั้งครรภ์ที่มีทารกตั้งแต่ 3 คนขึ้นไป มีความเสี่ยงสูงมากต่อมารดาและทารก และการย้ายตัวอ่อนเพียงตัวเดียวก็อาจทำให้เกิดครรภ์แฝดได้ ในรายที่มีปริมาณไข่ที่มีคุณภาพมาก และอายุน้อยกว่า 35 ปี ควรย้ายตัวอ่อนเพียงตัวเดียว หลักการย้ายตัวอ่อนที่เหมาะสมตามแนวทางปฏิบัติของ สมาคมอเมริกันเพื่อเวชศาสตร์การเจริญพันธุ์(ASRM) ดังตารางที่ 3
11. เก็บตัวอ่อนที่เหลือ (Cryopreservation of surplus embryos): หากมีตัวอ่อนที่เหลือ สามารถทำการเก็บตัวอ่อนโดยการแช่แข็งได้ ซึ่งหากจะนำมาใช้ต่อไปในอนาคต จะมีการเตรียมเยื่อบุโพรงมดลูกให้เหมาะสมก่อนการย้ายตัวอ่อน โอกาสที่จะตั้งครรภ์สำเร็จจากการใช้ตัวอ่อนที่แช่แข็งไว้ มีโอกาสในการตั้งครรภ์ที่ดีกว่ารอบที่ย้ายตัวอ่อนภายหลังการกระตุ้นไข่ทันที เนื่องจากมีความเป็นธรรมชาติมากกว่า
12. ดูแลการตั้งครรภ์ในระยะไตรมาสแรก (First trimester pregnancy monitoring): สามารถใช้การติดตามค่าการเพิ่มขึ้นของระดับฮอร์โมน hCG ในการดูการตั้งครรภ์ได้ หากค่าอยู่ที่ 200 mIU/mL ในวันที่ 12 หลังย้ายตัวอ่อนจะมีโอกาสตั้งครรภ์สูง

 

ระยะของตัวอ่อน	อายุ
	< 35 ปี	35 – 37 ปี	38 – 40 ปี	41 – 42 ปี
Cleavage-stage embryos
ตัวอ่อน euploid	1	1	1	1
เหมาะสม(other favorable)	1	1	≤ 3	≤ 4
อื่น ๆ	≤ 2	≤ 3	≤ 4	≤ 5
Blastocyst
ตัวอ่อน euploid	1	1	1	1
เหมาะสม(other favorable)	1	1	≤ 2	≤ 3
อื่น ๆ	≤ 2	≤ 2	≤ 3	≤ 3

 

ตารางที่ 3 แนวทางปฏิบัติสำหรับการย้ายตัวอ่อนที่เหมาะสม ASRM ปี 2017

แนวทางในการกระตุ้นการเจริญของไข่ และป้องกันการตกไข่

การที่จะได้ฟองไข่มาใช้สำหรับการทำ IVF หรือ ICSI นั้น มีได้หลายวิธี โดยส่วนใหญ่จะมีการใช้ยากระตุ้นไข่ (exogenous FSH; gonadotropin) และยาป้องกันการตกไข่(GnRH agonists หรือ GnRH antagonists) เพื่อให้ได้ไข่หลายใบ และในรายที่มีปัญหาการตกไข่ผิดปกติ ก็จำเป็นจะต้องใช้ยากระตุ้น สำหรับรายที่มีการตกไข่อยู่ตลอด การเก็บไข่โดยใช้การตกไข่ของร่างกายเอง หรือวิธีธรรมชาติ (natural cycle) สามารถทำได้ แต่ค่อนข้างยาก เนื่องจากต้องมาเฝ้าระวังการตกไข่และเก็บไข่ก่อนที่จะเกิด LH surge และจะได้ไข่ฟองเดียวเท่านั้น วิธีนี้ไม่จำเป็นต้องใช้ยา และสามารถป้องกันภาวะที่ไข่ถูกกระตุ้นมากเกินได้ (ovarian hyperstimulation syndrome)

วิธีต่อมาในการเก็บไข่คือ การใช้ยา Clomiphene Citrate ซึ่งเป็นวิธีที่เคยใช้ในอดีตแต่ปัจจุบันไม่ค่อยนิยมใช้แล้ว ตัวยาจะออกฤทธิ์โดยไปยับยั้ง negative feedback ของ estrogen receptor ที่ไฮโปทาลามัส ส่งผลให้มีการสร้าง gonadotropins (FSH, LH) ที่มากขึ้น โดยการใช้ Clomiphene Citrate 100 mg ต่อวัน เป็นเวลา 5-8 วัน เริ่มตั้งแต่วันที่ 3 ของรอบเดือน จะทำให้เกิดการเจริญของฟองไข่มากกว่า 1 ใบได้ในสตรีที่ตกไข่ตามปกติ ปริมาณไข่ที่ได้จะน้อยกว่าวิธีการใช้ยากระตุ้นไข่ และยาป้องกันการตกไข่ ทั้งนี้ การเก็บไข่ต้องเก็บก่อนที่จะเกิดการตกไข่ หรืออาจให้ exogenous hCG ในกรณีที่ฟองไข่เจริญเติบโตดี ร่วมกับให้ GnRH antagonists แล้วค่อยเก็บไข่ก็ได้ และในบางรายอาจให้ร่วมกับการใช้ gonadatropin เพื่อให้ฟองไข่เจริญได้มากขึ้น

1. GnRH Agonist Down-regulation Gonadotropin Stimulation – The long Protocol

เป็นวิธีการใช้ยาที่นิยมใช้มากที่สุด เพื่อกดการสร้าง gonadotropins ที่ร่างกายสร้างเองเพื่อป้องกันภาวะ LH surge หรือการตกไข่ก่อนกำหนด และเป็นการกระตุ้นไข่ให้เจริญโดย exogenous gonadotropin ที่ให้เข้าไป การให้ยาเริ่มดังนี้

• GnRH agonist เริ่มตั้งแต่หลังวันตกไข่ของรอบที่แล้ว 1 สัปดาห์ (midluteal phase) โดยใช้ leuprolide 1 mg เป็นเวลา 10 วัน แล้วลดเหลือ 0.5 mg จนกระทั่งถึงวันที่ให้ hCG
• Gonadotropin เริ่มตั้งแต่วันที่ 3 ของรอบเดือน โดยให้ urinary FSH หรือ recombinant FSH หรือ urinary menotropins ขนาด 150 – 300 IU โดยสามารถเริ่มจากขนาดต่ำ ๆ แล้วเพิ่มขนาดยา หรือ เริ่มจากขนาดสูง ๆ แล้วค่อย ๆ ลดขนาดยาก็ได้ ขึ้นกับการตอบสนองของฟองไข่ ซี่งโดยทั่วไปจะใช้เวลา 7-12 วันจึงจะมีการเจริญของฟองไข่ที่เหมาะสม เมื่อมีฟองไข่เฉลี่ยขนาด 17-18 mmอย่างน้อย 3 ฟอง จึงจะทำการให้ hCG และเข้าสู่การเก็บไข่ต่อไป นอกจากนี้ จะต้องดูความหนาของเยื่อบุโพรงมดลูกด้วย โดยความหนาที่เหมาะสม คือ 8-9 mm หรือมากกว่า
• hCG ให้ขนาด 5,000-10,000 IU เพื่อให้ไข่เจริญไปสู่ระยะสุดท้าย

ในรายที่การตอบสนองดีเกินไป (high responders) หรือน้อยเกินไป (low responder) จะต้องมีการปรับยาอย่างเหมาะสม หรืออาจยกเลิกในรอบนี้แล้วรอกระตุ้นไข่อีกในรอบถัดไป

รูปที่ 1 หลักการให้ยากระตุ้นไข่ แบบ The long protocol
(จาก Fritz MA, Speroff L. Clinical gynecologic endocrinology and infertility. 8th edition.) [1]

2. GnRH Agonist Flare Gonadotropin Stimulation Protocol

เป็นอีกวิธีหนึ่งที่ใช้ในการกระตุ้นไข่ได้ โดย อาจจะใช้ในกลุ่ม low responder ซึ่งการใช้วิธีนี้อาจจะให้ผู้ป่วยคุมรอบเดือนและกดการเจริญของไข่โดยทานยาเม็ดคุมกำเนิดก่อน การให้ยาเริ่มดังนี้

• GnRH agonist เริ่มตั้งแต่วันที่ 2-4 ของรอบเดือน โดยใช้ leuprolide 1 mg ในวันที่ 2-4 แล้วลดเหลือ 0.5 mg จนกระทั่งถึงวันที่ให้ hCG หากในรายที่ใช้ยาคุมกำเนิดมาก่อน อาจจะใช้ยาลดลงเหลือ 0.4 mg ได้
• Gonadotropin เริ่มตั้งแต่วันที่ 3 ของรอบเดือน หรือให้หลังลดขนาด GnRH agonist ลง โดยให้ urinary FSH หรือ recombinant FSH หรือ urinary menotropins ขนาด 225 – 400 IU โดยสามารถเริ่มจากขนาดต่ำ ๆ แล้วเพิ่มขนาดยา หรือ เริ่มจากขนาดสูง ๆ แล้วค่อย ๆ ลดขนาดยาก็ได้ มีการปรับขนาดยาตามการเจริญของไข่
• hCG ให้ขนาด 5,000-10,000 IU เพื่อให้ไข่เจริญไปสู่ระยะสุดท้าย

การใช้วิธีนี้ นิยมใช้ในรายที่เคยเป็น low responder โดยให้ร่วมกับการทานยาเม็ดคุมกำเนิด ซึ่งการเพิ่มขนาดของ FSH จะทำให้กระตุ้นไข่ได้สำเร็จมากขึ้น

รูปที่ 2 หลักการให้ยากระตุ้นไข่ แบบ GnRH Agonist Flare Gonadotropin Stimulation Protocol

(จาก Fritz MA, Speroff L. Clinical gynecologic endocrinology and infertility. 8th edition.) [1]

3. GnRH Antagonist Gonadotropin Stimulation Protocol

GnRH Antagonists ออกฤทธิ์ยับยั้งการตกไข่ได้เร็วกว่า กดการสร้าง gonadotropins ที่ร่างกายสร้างได้ดีกว่า และออกฤทธิ์สั้นกว่า GnRH agonists จึงสามารถนำไปใช้ในวันที่ 5-6 หลังจากได้ gonadotropin ได้ การให้ยาเริ่มดังนี้

• คุมรอบเดือนด้วยยาเม็ดคุมกำเนิดแล้วให้ Estradiol 2 mg 2 ครั้งต่อวัน เพื่อกด FSH ที่ร่างกายสร้าง
• Gonadotropin เริ่มตั้งแต่วันที่ 3 ของรอบเดือน (หยุด Estradiol หลังได้ gonadotropin หรือ 3 วัน หลังได้ gonadotropin ก็ได้)
• GnRH antagonist 0.25 mg ทุกวัน เริ่มหลังจากได้ gonadotropin 5-6 วัน
• hCG ให้ขนาด 5,000-10,000 IU เพื่อให้ไข่เจริญไปสู่ระยะสุดท้าย

รูปที่ 3 หลักการให้ยากระตุ้นไข่ แบบ GnRH Antagonist Gonadotropin Stimulation Protocol

(จาก Fritz MA, Speroff L. Clinical gynecologic endocrinology and infertility. 8th edition.) [1]

การเก็บน้ำเชื้อ หรืออสุจิ

ในเพศชายที่อสุจิมีความผิดปกติโดยทราบสาเหตุ เช่น การหลั่งน้ำอสุจิย้อนทาง(Retrograde ejaculation) สามารถใช้ยาในกลุ่มยากระตุ้นระบบประสาทซิมพาเธติคในการรักษาได้ หรือเก็บอสุจิในน้ำปัสสาวะภายหลังจากการช่วยตัวเอง โดยจะต้องทำให้ปัสสาวะเป็นด่าง

ในรายที่ไม่สามารถหลั่งน้ำอสุจิเองได้ เช่นได้รับการบาดเจ็บต่อไขสันหลังระดับต่ำกว่า T6 สามารถใช้เครื่องสั่นกระตุ้นให้หลั่งอสุจิได้ (vibratory stimulation and electroejaculation) หากไม่ตอบสนองสามารถใช้เครื่องกระตุ้นทางทวารหนักได้

ในรายที่ผ่าตัดทำหมันชายไปแล้ว หรือมีความผิดปกติของหลอดนำอสุจิแต่กำเนิด (congenital bilateral absence of the vas deferens; CBAVD) สามารถเก็บน้ำอสุจิได้ด้วยวิธีการดูดน้ำอสุจิจากบริเวณหลอดเก็บตัวอสุจิ (microsurgery epididymal sperm aspiration; MESA)

ในรายที่ตรวจไม่พบตัวอสุจิเลย และใช้วิธี MESA ไม่ได้ เช่น ไม่มีการเจริญของอสุจิจากถุงอัณฑะ (testicular failure) หรือไม่มีอสุจิหลังจากรับยาเคมีบำบัด สามารถใช้การตัดเนื้อเยื่อที่ถุงอัณฑะไปดูตัวอสุจิ (microsurgical testicular sperm extraction; TESE) และนำมาใช้ทำการผสมกับไข่ด้วยวิธี ICSI ได้

การวินิจฉัยความผิดปกติทางพันธุกรรมก่อนการฝังตัว(Preimplantation Genetic Diagnosis)

ปัจจุบันมีการวินิจฉัยความผิดปกติทางพันธุกรรมก่อนการฝังตัวอ่อนได้ โดยมีข้อบ่งชี้ในการทำสำหรับคู่เสี่ยงที่มีโอกาสมีลูกที่มีความผิดปกติ ซึ่งสามารถทำได้จากการนำบางส่วนของ polar bodies จากเซลล์ของไข่ก่อนที่จะทำการผสมกับอสุจิไปตรวจดู DNA ก่อนนำมาผสมได้ และหากทำการผสมไข่กับอสุจิแล้วสามารถนำบางส่วนของตัวอ่อนระยะ cleavage-stage รวมถึงระยะ blastocyst (ประมาณวันที่ 3-5หลังการผสมไข่และอสุจิ) ไปใช้ในการส่งตรวจดู DNA ได้เช่นกัน

สรุป

ปัญหาการมีบุตรยากต้องอาศัยการตรวจเพิ่มเติมและใช้เวลาในการรักษาอย่างยาวนาน และมีการรักษาอย่างหลากหลายวิธี คู่สมรสควรมีความพร้อมทั้งทางด้านร่างกาย และจิตใจในการรักษา ต้องอาศัยความเข้าใจ และการแนะนำอย่างถูกต้อง การใช้เทคโนโลยีช่วยการเจริญพันธุ์เป็นอีกวิธีหนึ่งที่ช่วยให้คู่สมรสประสบความสำเร็จได้และมีแนวทางปฏิบัติที่หลากหลายในปัจจุบัน

เอกสารอ้างอิง

1. Fritz MA, Speroff L. Assisted Reproductive Technologies In: Clinical gynecologic endocrinology and infertility. 8th ed. Philadelphia: Wolters Kluwer Health/Lippincott Williams & Wilkins; 2011. p. 1331-82.
2. ธีระ ทองสง. นรีเวชวิทยา (ฉบับสอบบอร์ด). 4rd ed. ภาวะมีบุตรยาก-infertility. 2559, กรุงเทพฯ: พี.บี.ฟอเรน บุ๊ค เซนเตอร์.p. 637-652
3. Aubuchon M, Burney RO, Schust DJ, Yao MW. Infertility and Assisted Reproductive Technology In: Berek and Novak’s Gynecology.15 ed. Philadelphia: Lippincott Williams and Wilkins; 2012. p. 1133-89.
4. Practice Committee of the American Society for Reproductive Medicine, Practice Committee of the Society for Assisted Reproductive Technology. Role of assisted hatching in in vitro fertilization: a guideline. Fertil Steril 2014; 102:348.
5. Practice Committee of the American Society for Reproductive Medicine. Progesterone supplementation during the luteal phase and in early pregnancy in the treatment of infertility: an educational bulletin. Fertil Steril 2008; 89:789.
6. Practice Committee of the American Society for Reproductive Medicine, Practice Committee of the Society for Assisted Reproductive Technology. Guidance on the limits to the number of embryos to transfer: committee opinion. Fertil Steril 2017; 107:901.
7. Reproductive Technology. Intracytoplasmic sperm injection (ICSI) for non-male factor infertility: a committee opinion. Fertil Steril 2012; 98:1395.
8. Boulet SL, Mehta A, Kissin DM, Warner L, Kawwass JF, Jamieson DJ. Trends in use of and reproductive outcomes associated with intracytoplasmic sperm injection. JAMA. 2015;313(3):255-63. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/25602996
9. www.cdc.gov/art. (accessed August 10, 2017).