Font Size

Profile

Menu Style

Cpanel

01August2021

You are here: Home Lecture/Topic Residents / Fellows Fluorescence in situ Hybridization (FISH)

Fluorescence in situ Hybridization (FISH)

การตรวจวินิจฉัยก่อนการฝังตัวโดยวิธี

Fluorescence in situ Hybridization (FISH)

โอภาส เศรษฐบุตร

            การตรวจวินิจฉัยก่อนการฝังตัว (preimplantation genetic diagnosis; PGD) เป็นทางเลือกอีกทางหนึ่งในการวินิจฉัยความผิดปกติทางพันธุกรรมของทารก นอกเหนือจากการวินิจฉัยทารกก่อนคลอด (prenatal diagnosis; PND) ที่มีการปฏิบัติกันอยู่แล้ว เช่น การตัดชิ้นเนื้อรก (chorionic villus sampling; CVS) การเจาะน้ำคร่ำ (amniocentesis) และการเจาะเลือดจากสายสะดือ (cordocentesis) โดยข้อจำกัดของการวินิจฉัยก่อนคลอดซึ่งเป็นการตรวจหลังจากที่มีการตั้งครรภ์เกิดขึ้นแล้ว คือ มีโอกาสเสี่ยงต่อการเกิดการแท้งบุตรจากกระบวนการตรวจ และในกรณีที่พบว่าทารกในครรภ์มีความผิดปกติจำเป็นต้องมีการยุติการตั้งครรภ์จะทำให้มีผลกระทบต่อสุขภาพร่างกายและจิตใจของมารดา ส่วนการวินิจฉัยก่อนการฝังตัวนั้นทำก่อนที่จะมีการตั้งครรภ์เกิดขึ้นจึงไม่มีผลกระทบดังเช่นที่กล่าวมา แต่อย่างไรก็ตามการวินิจฉัยก่อนการฝังตัวจำเป็นต้องอาศัยเทคโนโลยีช่วยการเจริญพันธุ์ในการทำให้เกิดการปฏิสนธินอกร่างกาย แล้วทำการเลี้ยงตัวอ่อนเพื่อนำเซลล์ออกมามาตรวจ และยังต้องอาศัยห้องปฏิบัติการในการตรวจวินิจฉัยทางพันธุกรรมที่ซับซ้อน

            การวินิจฉัยก่อนการฝังตัวนั้นประสบความสำเร็จครั้งแรกในปี ค.ศ.1990 โดยเป็นการตรวจเพศจากเซลล์ของตัวอ่อนที่มีความเสี่ยงต่อโรคที่ถ่ายทอดทางโครโมโซมเพศ (sex-linked disease) โดยวิธีปฏิกิริยาลูกโซ่ (polymerase chain reaction : PCR)(1) หลังจากนั้นได้มีการนำมาใช้ในการตรวจ single gene disorders อื่นๆ เช่น cystic fibrosis ซึ่งในปัจจุบันมีโรคที่สามารถตรวจได้มากกว่า 40 ชนิด(2) ต่อมาได้มีการนำวิธีการตรวจด้วยสารเรืองแสง (fluorescence in situ hybridization : FISH) มาใช้โดยเฉพาะในการวินิจฉัยความผิดปกติของจำนวนโครโมโซม (aneuploidy) ทำให้มีข้อบ่งชี้ในการการตรวจวินิจฉัยก่อนการฝังตัวเพิ่มขึ้นจากการตรวจในรายที่มีความเสี่ยงต่อ sex-linked disease และ single gene disorder เป็นกลุ่มที่มีความเสี่ยงต่อความผิดปกติของจำนวนโครโมโซม รวมทั้ง ความผิดปกติทางโครงสร้างของโครโมโซม เช่น translocation ได้แก่ ผู้ที่มีปัญหาแท้งเป็นอาจิณ (recurrent abortion), การล้มเหลวจากการทำเด็กหลอดแก้วหลายๆครั้ง (repeated IVF failure), เป็นพาหะของ translocation และกลุ่มสตรีที่มีอายุมากซึ่งต้องการตั้งครรภ์(2)

เซลล์ที่สามารถนำมาใช้ในการวินิจฉัยก่อนการฝังตัว มีการนำเซลล์จากตัวอ่อนออกมาตรวจโดยวิธีจุลศัลยกรรม (micromanipulation) ซึ่งสามารถทำได้โดย

  1. การทำ polar body analysis(3, 4) โดยทำการดูด first และ second polar body จากตัวอ่อนระยะเซลล์เดียว ซึ่งมีข้อดีคือไม่มีผลต่อการพัฒนาและการฝังตัวของตัวอ่อน แต่ก็มีข้อจำกัดคือ เป็นการตรวจทางพันธุกรรมของไข่ ซึ่งมาจากฝ่ายมารดาเท่านั้น ไม่สามารถตรวจความผิดปกติที่มาจากฝ่ายบิดาได้
  2. การทำ blastomere biopsy จากตัวอ่อนในระยะ cleavage(3,4)  เป็นวิธีที่ได้รับความนิยมมากที่สุด โดยการนำเซลล์ 1-2 เซลล์ออกจากตัวอ่อนในระยะ 6-8 เซลล์ หรือประมาณวันที่ 3 ของการเลี้ยงตัวอ่อน ซึ่งไม่ทำให้การพัฒนาของตัวอ่อนผิดปกติ และมีเวลาเพียงพอในการตรวจทางพันธุกรรม ก่อนที่จะทำการย้ายตัวอ่อน
  3. การทำ trophectoderm biopsy ในระยะ  blastocyst(4) ในระยะนี้สามารถทำการตัดเซลล์ออกมาหลายเซลล์ได้โดยไม่มีผลต่อตัวอ่อน แต่ก็มีข้อจำกัดคือ พบว่ามีประมาณครึ่งหนึ่งของตัวอ่อนเท่านั้นที่สามารถพัฒนามาถึงระยะนี้ได้ และยังพบภาวะ mosaicism ใน trophectoderm ได้บ่อยกว่าใน inner cell mass

เมื่อได้เซลล์มาแล้ว สามารถนำไปตรวจทางพันธุกรรมได้สองวิธี คือ การตรวจด้วยวิธี วิธีปฏิกิริยาลูกโซ่ และ วิธีการตรวจด้วยสารเรืองแสง ซึ่งในที่นี้จะกล่าวถึงเฉพาะวิธีการตรวจด้วยสารเรืองแสง (และวิธีที่เกี่ยวข้องเท่านั้น)

 

วิธีการตรวจด้วยสารเรืองแสง (Fluorescence in situ Hybridization : FISH)

            เป็นการตรวจหา DNA ที่มีลำดับ nucleotide ที่จำเพาะในเซลล์ที่ต้องการตรวจ โดยใช้ DNA probe ที่มีลำดับของ nucleotide ที่สามารถจับกับ DNA ที่ต้องการตรวจได้ โดยมีการติด reporter molecule ไว้กับ probe ซึ่ง reporter molecule นี้อาจใช้เป็นสารกัมมันตรังสี เอนไซม์ หรือสารเรืองแสง(5) ในการตรวจด้วยวิธี FISH จะใช้ reporter molecule เป็นสองกลุ่ม ได้แก่

  1. direct FISH จะใช้สารเรืองแสง เช่น rhodamine ทำหน้าที่เป็น reporter molecule ติดกับ probe โดยตรง
  2. indirect FISH จะใช้เป็น hapten-labelled probe โดยใช้ biotin หรือ digoxigenin ติดกับ probe ซึ่งในขั้นตอนการอ่านผลจะต้องมีการใช้สารที่สามารถจับกับ biotin (คือ antibiotin antibody หรือ avidin) และ digoxigenin (คือ antidigoxigenin antibody) ที่ติดด้วยสารเรืองแสง เช่น fluorescein isothiocyanate (FITC) เป็นต้น

 

ขั้นตอนต่างๆในการทำ  FISH(5, 6)

  1. การเตรียมเซลล์ที่ต้องการตรวจ หลังจากที่ได้เซลล์มาแล้ว จะต้องทำการ fix เซลล์ติดกับสไลด์ แล้วทำการย่อยโปรตีนในนิวเคลียสและ cytoplasm ออก เพื่อให้ probe สามารถจับกับ DNA ที่ต้องการตรวจได้
  2. ทำให้ DNA ในเซลล์ และ probe เกิดการ denature คือมีการแยกของ DNA สายคู่ออกเป็นสายเดี่ยวๆ โดยอาศัยความร้อน
  3. Hybridization เป็นกระบวนการที่ probe เข้าไปจับกับ DNA ที่มีลำดับของกรดนิวคลีอิกที่จำเพาะหลังจากที่ถูกแยกให้เป็นสายเดี่ยวๆ แล้ว
  4. ทำการล้างเพื่อเอา probe ส่วนเกิน หรือ probe ที่จับแบบไม่จำเพาะออก (post-hybridization wash)
  5. Detection เป็นการตรวจหา probe ที่จับอยู่กับ DNA ที่จำเพาะ โดยอาศัย reporter molecule ซึ่งใน indirect FISH reporter molecule จะเป็น biotin หรือ digoxigenin ซึ่งจะต้องอาศัย antibiotin antibody หรือ avidin และ antidigoxigenin antibody ที่ถูกติดฉลากด้วยสาร fluorescene ก่อนจึงจะนำไปตรวจวัดได้
  6. การอ่านสัญญาณ (visualization)  โดยการนำไปส่องด้วยกล้องจุลทรรศน์เรืองแสง โดยอาศัยคุณสมบัติพิเศษของสารเรืองแสง เมื่อดูดกลืนแสงที่มีความยาวคลื่นระดับหนึ่ง และจะปลดปล่อยแสงที่มีความยาวคลื่นที่มากกว่าออกมา ซึ่งในกล้องจุลทรรศน์เรืองแสงจะมีชุด filter ที่ยอมให้แสงที่มีความยาวคลื่นที่เหมาะสมผ่านไปกระตุ้นต่อสารเรืองแสง สารเรืองแสงก็จะปลดปล่อยแสงที่มีความยาวคลื่นอีกขนาดหนึ่งออกมา และจะมี filter อีกอันหนึ่งที่จะยอมให้แสงนี้ผ่านเข้าสู่ดวงตาโดยที่ไม่ยอมให้แสงที่มีความยาวคลื่นอื่นๆผ่าน จะสามารถเห็นบริเวณที่มีสารเรืองแสงเป็นจุดที่เรืองแสงบนพื้นหลังสีดำ

 

ข้อจำกัดในการตรวจวินิจฉัยตัวอ่อนก่อนการฝังตัวด้วย FISH

  1. เนื่องจากการตรวจ PGD เป็นการตรวจจาก blastomere จำนวน 1-2 เซลล์ ทำให้มีข้อจำกัดในการที่จะวินิจฉัยภาวะ mosaicism  ซึ่งมีลักษณะทางพันธุกรรมที่แตกต่างกันมากกว่า 1 แบบในตัวอ่อนเดียวกัน(5)
  2. ในตัวอ่อนระยะที่ทำการตรวจนี้สามารถพบความผิดปกติของโครโมโซมที่แตกต่างไปจากที่พบในช่วงหลังของการตั้งครรภ์  เป็นการยากที่จะเลือกโครโมโซมที่จะทำการตรวจ ซึ่งในทางที่ดีที่สุดควรจะต้องตรวจโครโมโซมทุกคู่ แต่ข้อจำกัดในการตรวจด้วย FISH นั้นสามารถตรวจโครโมโซมได้เพียงไม่กี่คู่ (ส่วนใหญ่ตรวจได้ 5-9 คู่)(2, 5) ทำให้ความผิดปกติบางชนิดอาจไม่สามารถตรวจพบได้
  3. ความผิดพลาดทางเทคนิค(5) อาจเกิดจากการสูญเสียโครโมโซมไประหว่างขั้นตอน fixation หรือ denaturation การย้อมโครโมโซมติดเพียงตัวเดียว หรือการซ้อนทับกันของสัญญาณ อาจทำให้เกิดความผิดพลาดในการแปลผลได้
  4. การที่บาง blastomere มีนิวเคลียสมากกว่าหนึ่งอัน (multinucleated blastomere; MNB) พบได้ประมาณร้อยละ 15-30 ซึ่งอาจมีจำนวนโครโมโซมในแต่ละนิวเคลียสแตกต่างกัน ทำให้เกิดความผิดพลาดในการแปลผลได้(5)

 

เทคนิคการตรวจทางอณูพันธุศาสตร์อื่นๆที่เกี่ยวข้องกับ fluorescence in situ hybridization

  1. nuclear conversion(2, 5) เนื่องจากการตรวจทางพันธุกรรมหลายๆวิธีจะต้องทำในระยะ metaphase ซึ่งโครโมโซมมีการขดตัวแน่นและแยกออกจากตัวอื่นๆได้ชัดเจน แต่ blastomere ที่ นำมาตรวจมักจะอยู่ในระยะ interphase จึงต้องมีการทำให้เข้าสู่ระยะ metaphase ก่อนที่จะนำไปตรวจด้วยวิธีอื่นๆ เช่น การทำ G-banding, chromosome painting และ spectral karyotyping

ส่วนหลักการของ nuclear conversion ทำโดยนำเซลล์ blastomere ไป fuse กับเซลล์ไข่ที่ถูกดูดเอา nucleus ออกแล้ว (enucleated oocyte) โดยอาศัยกระแสไฟฟ้าเป็นตัวกระตุ้นให้เซลล์เชื่อมติดกัน จากนั้นนำมาเลี้ยงในน้ำยาที่มี  okadaic acid หรือ colcemid  เพื่อให้เกิด premature chromosome condensation และ metaphase arrest แล้วจึงนำไปตรวจทางพันธุกรรมต่อไป แต่อย่างไรก็ตามยังพบว่าบางการที่มีการซ้อนทับกันของโครโมโซม หรือการสูญหายของบางโครโมโซมทำให้ผลการตรวจมีความผิดพลาดได้

  1. Comparative Genomic Hybridization หรือ CGH(2, 7, 8, 9) เป็นวิธีการตรวจหาความผิดปกติของโครโมโซมที่สามารถตรวจโครโมโซมทุกคู่ โดยที่ไม่จำเป็นต้องทำให้อยู่ในระยะ metaphase ก่อน หลักการของวิธีนี้ คือ นำ DNA ที่ได้จากตัวอย่างที่ต้องการตรวจมาติดฉลากด้วยสารเรืองแสงที่ให้แสงสีเขียว และนำ DNA จากเซลล์ที่มีโครโมโซมปกติมาติดฉลากด้วยสารเรืองแสงที่ให้แสงสีแดง จากนั้นนำส่วนผสมของ DNA ทั้งสองอย่างนี้ไป hybridize บน metaphase chromosome ของคนปกติที่เตรียมไว้บน slide แล้วจึงนำไปส่องด้วยกล้องจุลทรรศน์ fluorescence ในกรณีที่ตัวอย่างที่ต้องการตรวจมีโครโมโซมปกติ DNA ของตัวอย่างและ DNA ปกติจะสามารถแย่งจับกับ metaphase chromosome ในสัดส่วนที่เท่ากัน สัญญาณที่เห็นจะเป็นสีเหลืองที่เกิดจากการผสมกันของสีเขียวและสีแดง ถ้าตัวอย่างมีโครโมโซมหรือส่วนของโครโมโซมคู่ใดเกินมา เช่น  trisomy หรือ unbalanced translocation ก็จะทำให้มีสัดส่วนของ DNA ของตัวอย่างในบริเวณนั้นสูงขึ้น สัญญาณที่เห็นในบริเวณนั้นก็จะเป็นสีเขียว ในทางตรงข้ามถ้าในตัวอย่างมีโครโมโซมหายไป เช่น monosomy หรือ deletion สัดส่วนของ DNA ของตัวอย่างในบริเวณนั้นจะลดลง ก็จะทำให้บริเวณนั้นเห็นเป็นสีแดง ซึ่งการตรวจสัดส่วนของสีของสัญญาณนี้ต้องอาศัยโปรแกรมคอมพิวเตอร์ที่ซับซ้อน จึงจะสามารถแยกความแตกต่างของสีได้(7) ส่วนข้อจำกัดอีกอย่างหนึ่งของวิธีนี้คือบอกได้แต่ว่ามีการขาดหรือเกินของโครโมโซมเท่านั้น แต่จะไม่สามารถวินิจฉัยความผิดปกติทางโครงสร้างของโครโมโซม โดยที่ไม่มีการขาดหรือเกินของ DNA เช่น balanced translocation, inversion หรือ ring chromosomeได้(7)

ในการตรวจด้วยวิธี CGH นี้จะต้องใช้ DNA อย่างน้อย 200 นาโนกรัม เมื่อนำมาใช้ในการตรวจ blastomere ที่มีเพียงเซลล์เดียว จะต้องมีการเพิ่มปริมาณ DNA ก่อน ด้วยวิธี whole genome amplification (WGA) ที่สามารถได้เพิ่มปริมาณ DNA ได้ไม่น้อยกว่า 10,000 เท่า ซึ่งเพียงพอสำหรับ CGH และ PCR ในครั้งเดียวกัน(2, 5, 7)

  1. Spectral Karyotyping (SKY)(5)  เป็นการตรวจโครโมโซมในระยะ metaphase ทั้ง 23 คู่ ด้วยวิธี  FISH โดยใช้ probe ต่อโครโมโซมทั้งตัว (painting probe) ของโครโมโซมทุกตัว แต่เนื่องจากข้อจำกัดของจำนวนชนิดของสารเรืองแสงมีน้อยกว่าจำนวนโครโมโซม จึงใช้วิธีการปิดฉลาก probe โครโมโซมแต่ละตัวด้วยสารเรืองแสง 5 ชนิดในอัตราส่วนที่แตกต่างกัน (ratio labeling) ซึ่งเฉดสีที่ได้จะไม่สามารถแยกได้ด้วยตาเปล่า จึงต้องอาศัยคอมพิวเตอร์ช่วยในการวิเคราะห์ spectrum ของสีที่แสดงออกมาแล้วแปลงเป็นสีที่ได้รับการกำหนดมาเฉพาะโครโมโซมแต่ละตัวบนจอมอนิเตอร์เพื่อให้ผู้อ่านสามารถบอกถึงความแตกต่างของโครโมโซมแต่ละตัวได้
  2. DNA microarray เป็นเทคนิคที่พัฒนาล่าสุด โดยอาศัยการนำ DNA sequence ที่ต้องการตรวจมาจัดวางตามตำแหน่งต่างๆบนแผ่นกระจกเล็กๆของชิพ ซึ่งสามารถบรรจุชนิดของยีนที่ต้องการตรวจได้มากมายหลายยีน จากนั้นจึงนำ DNA ของตัวอย่างที่ต้องการตรวจและ DNA ของ control ที่ได้รับการติดฉลากด้วยสารเรืองแสงต่างสีกัน มา hybridize บนแผ่นชิพ แล้วจึงนำไปอ่านสัญญาณโดยอาศัยโปรแกรมคอมพิวเตอร์เพื่อว่า DNA ของตัวอย่างมียีนผิดปกติใด(5) การแบ่งประเภทของชิพตามการใช้งานแบ่งได้ดังนี้
    1. Expression chips เป็นการตรวจการแสดงออกของยีน โดยทำการสร้าง DNA จาก mRNA โดยวิธี reverse transcriptase PCR ซึ่ง mRNA นี้เกิดจากการ transcription ของยีนที่มีการแสดงออกจากเซลล์ตัวอย่าง จากนั้นนำ DNA ที่ได้มาผสมกับ DNA ที่เป็น control ซึ่งติดฉลากด้วยสารเรืองแสงคนละสีกัน แล้วนำไป hybridize กับ DNA บนชิพ แล้วแปลผลจากเฉดสีของสัญญาณก็จะบอกได้ว่าในเซลล์ตัวอย่างมีการแสดงออกของยีนที่ต้องการตรวจหรือไม่ (5, 10)
    2. Minisequencing chip เป็นชิพที่ใช้ตรวจหาการกลายพันธุ์ (mutation) ของยีน โดยจะนำปลายด้าน 5’ ของสาย oligonucleotide ที่มีความยาว 18-25 bases มาติดกับชิพ โดยสาย oligonucleotide นี้จะถูกออกแบบให้จับกับ DNA ของยีนที่ต้องการตรวจได้พอดี และปลายด้าน 3’ จะสิ้นสุดที่ 1 base ก่อนที่จะถึงตำแหน่งที่มีการกลายพันธุ์พอดี เมื่อนำ DNA ตัวอย่างมา hybridize บนชิพ DNA sequence ของยีนที่ต้องการตรวจจะถูกจับกับ oligonucleotide ที่ติดอยู่กับชิพ จากนั้นทำการเติม di-deoxynucleoside triphosphase (ddNTP) อีก 1 ตัวต่อไปจากปลาย 3’ ของสาย oligonucleotide โดยเอนซัยม์ DNA polymerase  ซึ่ง ddNTP ที่ใช้เติมเข้าไปจะถูกติดฉลากด้วยสารเรืองแสงต่างชนิดกันตามชนิดของเบสในโมเลกุล เมื่อนำชิพมาอ่านสีก็จะทราบว่าตำแหน่งที่มีการกลายพันธุ์จะมีลำดับของเบสเป็นอย่างไร(5, 10) ซึ่งในชิพ 1 อันสามารถทำการตรวจได้หลายยีน
    3. ชิพสำหรับการตรวจ aneuploidy อาศัยหลักการเดียวกับ expression chips แต่อาศัยการเปลี่ยนแปลงของปริมาณ DNA ที่เกิดจากการเกินหรือขาดของโครโมโซมในตัวอย่างเพื่อทำให้เกิดการเปลี่ยนแปลงของเฉดสี ซึ่งการตรวจความแตกต่างของปริมาณของโครโมโซมนี้ยังทำได้ยาก จึงยังไม่มีการผลิตเพื่อการพานิชย์(5, 10)

 

เอกสารอ้างอิง

  1. Handyside AH, Kontogianni EH, Hardy K, Winston RM. Pregnancies from biopsied human preimplantation embryos sexed by Y-specific DNA amplification. Nature. 1990 Apr 19; 344 (6268): 768-70.
  2. Wells D. Advances in preimplantation genetic diagnosis. Eur J Obstet Gynecol Reprod Biol. 2004 Jul 1; 115 Suppl 1: S97-101.
  3. Harper JC, Bui TH. Pre-implantation genetic diagnosis. Best Pract Res Clin Obstet Gynaecol. 2002 Oct; 16(5): 659-70.
  1. อุษณีย์ เจตสว่างศรี. การตัดชิ้นเนื้อจากตัวอ่อน Embryo biopsy. ใน : ธีระพร วุฒยวนิช, บรรณาธิการ. เทคโนโลยีช่วยการเจริญพันธุ์. เชียงใหม่: บริษัท นพบุรีการพิมพ์ จำกัด; 2546. หน้า 223-8.
  2. ธีระพร วุฒยวนิช. การตรวจด้วยสารเรืองแสง fluorescence in situ hybridization (FISH). ใน : ธีระพร วุฒยวนิช, บรรณาธิการ. เทคโนโลยีช่วยการเจริญพันธุ์. เชียงใหม่: บริษัท นพบุรีการพิมพ์ จำกัด; 2546. หน้า 237-51.
  1. McDonough PG. Molecular biology and the reproductive sciences. In: Yen SCC Jr, Barbieri RL, editors. Reproductive endocrinology : physiology, pathophysiology, and clinical management. 4th ed. Philadelphia : W.B. Saunders, 1999: 3-29.
  2. Weiss MM, Hermsen MA, Meijer GA, van Grieken NC, Baak JP, Kuipers EJ, van Diest PJ. Comparative genomic hybridisation. ol Pathol. 1999 Oct; 52(5): 243-51.
  3. Wells D, Sherlock JK, Handyside AH, Delhanty JDA. Detailed chromosomal and molecular genetic analysis of single cells by whole genome amplification and comparative genomic hybridization. Nucleic Acids Research. 1999; 27(4): 1214-8.
  4. Kallioniemi A, Kallioniemi OP, Sudar D, Rutovitz D, Gray JW, Waldman F, Pinkel D. Comparative genomic hybridization for molecular cytogenetic analysis of solid tumors. Science. 1992; 258: 818-21.
  5. Wells D. Molecular tools for assessing genes and chromosomes in single cells. In: Annual review preimplantation embryology. Cancun, Mexico; January 8-10, 2001: 211-8.

Login Form